氮肥調(diào)控稻米蛋白質(zhì)含量機(jī)制初探

周建

（揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的人開始關(guān)注稻米品質(zhì)。稻米品質(zhì)包括稻米外觀品質(zhì)、碾磨品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)四個方面[1]。其中，蒸煮食味品質(zhì)最受消費(fèi)者關(guān)注。已有研究表明，稻米蛋白質(zhì)含量對蒸煮食味品質(zhì)有顯著的負(fù)向影響，稻米蛋白質(zhì)含量越高，營養(yǎng)品質(zhì)越高，但稻米適口性卻越差。目前增施氮肥的同時，稻米蛋白質(zhì)含量也顯著增加，蛋白質(zhì)的含量影響著稻米的蒸煮食味品質(zhì)[2]。然而，目前氮肥如何調(diào)控稻米蛋白質(zhì)的機(jī)制尚不清楚。氮素是促進(jìn)植物生長的重要營養(yǎng)元素，對保障農(nóng)作物高產(chǎn)極為關(guān)鍵。而植物生長的直觀體現(xiàn)為生物量的積累。植物吸收氮素后通過氮同化等一系列代謝過程，生成核酸、蛋白等大量功能元件以滿足光合作用及生長所需。[3-4]本研究利用實驗室已有的水稻近等基因系，對其不同氮肥處理，并選取花后14天胚乳做RNA-Seq，從組學(xué)水平對施肥調(diào)控稻米蛋白質(zhì)含量機(jī)制初探。

1 材料和方法

1.1 供試材料

我們選擇CSSL SL402作為供體親本與背景親本Sasanishiki進(jìn)行雜交，構(gòu)建HH、HS、DH、DS近等基因系，選擇HH對其進(jìn)行低氮（LN 2.2 g/盆）、中氮（MN 4.4 g/盆）、高氮（HN 6.6 g/盆）氮肥處理，同時選取花后14天胚乳做RNA-Seq。

1.2 精米總蛋白測定

利用FOSSTECATOR全自動凱氏定氮儀進(jìn)行總蛋白測定。

1.3 組分蛋白提取

利用BCA法測定米粉谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量分析

水稻蛋白質(zhì)以谷蛋白、醇溶蛋白為主，清蛋白和球蛋白在稻米蛋白質(zhì)中所占比例很少。通過比較HH在LN、MN、HN處理條件下發(fā)現(xiàn)，HH在MN條件下比LN上升11.22%，在HN條件下比MN上升3.26%。總蛋白含量從LN到MN極顯著增加，MN到HN增加不顯著。同時分析了HH的組分蛋白含量發(fā)現(xiàn)，稻米總蛋白含量增加主要是由于谷蛋白和醇溶蛋白含量增加導(dǎo)致在統(tǒng)計學(xué)上達(dá)到顯著水平，然而清蛋白和球蛋白增加并不是很明顯。（見表1）。

表2.1 蛋白含量（mg/g）分析

2.2 HH在中低、高低氮肥處理下同時上調(diào)下調(diào)基因分析

通過對HH在低中，高低氮肥處理下同時上調(diào)下調(diào)的基因的GO進(jìn)行富集發(fā)現(xiàn)，在BP中富集主要包括細(xì)胞過程（Cellular process）、代 謝 過 程（Metabolic processs）、生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）、細(xì)胞成分的組織或生物發(fā)生（Cellular component organization or biogenesis）、發(fā)育過程（Development process）、多細(xì)胞生物過程（Multicellular organismal process）、生物過程的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of biological process）、排 毒（Deltoxification）、免疫系統(tǒng)過程（Immune system process）、細(xì)胞增殖（Cell proliferation）、生長（Growth）、氮素利 用（Nitrogen utilization）等方面，在CC中顯著富集主要包括細(xì)胞（cell）、細(xì)胞部分（Cell part）、細(xì)胞器（Organelle）、膜部分（Membrane part）、含蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex）、細(xì)胞外區(qū)域（Extracellular region）、細(xì)胞連接（Cell junction）、細(xì)胞外區(qū)域部分（Extracellular region part）、在MF中主要包括捆綁（Binding）、催化活性（Catalytic activity）、轉(zhuǎn)運(yùn)活動（transporter activity）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（Transcription regulator activity）、分子功能調(diào)節(jié)劑（Molecular function regulator）、營養(yǎng)物儲存活動（Nutrient reservoir activity）。這些差異表達(dá)基因大多數(shù)富集在代謝，和貯藏物質(zhì)形成等相關(guān)富集上，尤其在氮素利用上，這些差異基因的富集可能導(dǎo)致稻米蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化（圖1）。

圖1 HH在中低、高低氮肥處理下同時上調(diào)下調(diào)基因GO富集

2.3 貯藏蛋白相關(guān)基因分析

通過RNA-Seq測序，我們檢測到大量醇溶蛋白前體和谷蛋白相關(guān)基因上調(diào)。同種材料只改變施氮量，其他外界條件不變的情況下，增施氮肥主要是通過上調(diào)醇溶蛋白前體和谷蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量，從而使稻米蛋白質(zhì)含量增加。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶如BiP， PDI 等介導(dǎo)貯藏蛋白在種子成熟過程中特異大量合成并經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積在蛋白體PB內(nèi)，對蛋白質(zhì)的形成至關(guān)重要。在我們實驗中發(fā)現(xiàn)Os02g0115900編碼OsBip1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因發(fā)生上調(diào)。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）作為一個分子伴侶，通過行使催化和協(xié)助在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊功能而參與氧化蛋白的折疊。已有研究表明略微增加BiP1的表達(dá)水平伴隨著鈣連蛋白和類蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白水平的增加，從而導(dǎo)致種子貯藏蛋白的增加，因此我們猜測這兩類相關(guān)基因的上調(diào)，最終導(dǎo)致蛋白含量升高。

3 小結(jié)與討論

氮肥的大量施用保證產(chǎn)量，但是也會導(dǎo)致稻米蛋白質(zhì)含量增加，蛋白質(zhì)含量越高，稻米的適口性就越差。我們通過不同氮肥的處理發(fā)現(xiàn)稻米總蛋白質(zhì)含量是上升的，測定組分蛋白發(fā)現(xiàn)總蛋白的上升主要是谷蛋白和醇溶蛋白上升引起。此外，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，增施氮肥后谷蛋白和醇溶蛋白前體相關(guān)基因上調(diào)，因此我們推測增施氮肥后，谷蛋白和醇溶蛋白相關(guān)前體基因上調(diào)最終導(dǎo)致稻米蛋白質(zhì)含量上升。