基于核酸適配體檢測飼料中黃曲霉毒素B1的方法

彭臻菲，李泳寧，黃 慧，陳雅婷，林殿霞

(福建衛生職業技術學院， 福建 福州 350101)

0 引言

【研究意義】食品、農產品、飼料發霉變質是一個全球性的嚴重問題，其產生的霉菌毒素危害極大，對人和動物具有很強的毒性作用。霉菌毒素是由霉菌產生的有毒次級代謝產物，已知的霉菌毒素約有300種，黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產生的次級代謝產物，是一族結構相似、毒性極強的化合物，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最強，具有強致畸、致突變、致癌作用[1-3]，因此黃曲霉毒素引起的污染問題越來越受到人們的關注，而建立快速、靈敏的檢測方法是確保食品和農產品安全使用的重要保障。【前人研究進展】目前，對AFB1的分析檢測方法已有大量研究，主要有薄層層析法[4]、高效液相色譜法[5]、酶聯免疫法[6]、液質聯用法[7]和生物傳感器法[8]等，這些方法均能實現對AFB1的定量和定性分析，但更方便、快速、準確的檢測方法仍是目前研究的熱點?！狙芯壳腥朦c】近年來，快速發展的基于核酸適配體的檢測技術由于其靈敏度高和特異性強，成為國內外研究的重點。核酸適配體和抗體一樣具有高度特異性和親和力，已廣泛應用于抗生素[9]、霉菌毒素[10]、蛋白質[11]及整個細胞[12]的檢測?！緮M解決的關鍵問題】利用與AFB1具有高特異性結合的核酸適配體末端標記熒光，其與AFB1特異性結合后空間構象的改變，與偶聯BHQ1的互補序列無法配對，導致熒光值變化而實現對飼料中AFB1的快速、簡便、高靈敏度檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、桔霉素(citrinin，CIT)、赭曲霉素A(ochratoxin A，OTA)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)均為Sigma公司生產，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為北京索萊寶公司生產，鏈親和素為上海源葉生物公司生產；AFB1核酸適配體5′-6-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC-3′Biotin，結合探針5′-GACAACACGTGCCCAAC-3′-BHQ1參考文獻[13]設計，由福州尚亞生物技術有限公司合成；其他試劑均為分析純；超聲波提取儀(KQ-700DE)為昆山超聲儀器有限公司生產，SpectraMax M3多功能酶標儀為美國Molecular Devices公司生產。

1.2 檢測方法

1.2.1 鏈親和素包被濃度的優化 鏈親和素用碳酸鈉溶液進行稀釋，濃度分別為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL和1 000 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃包被過夜，用1% BSA進行封閉2 h后用PBST清洗3次，扣干。加入1 000 nmol/L核酸適配體進行反應，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干。采用酶標儀檢測其熒光值，激發波長為488 nm，吸收波長為518 nm。

1.2.2 核酸適配體濃度的優化 為使標記生物素核酸適配體與包被于板上的鏈親和素反應達到平衡，將核酸適配體用Tris-HCl 緩沖液(pH 7.5，NaCl 120 mmol/L、MgCl240 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )稀釋成濃度分別為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1 000 nmol/L，在包被鏈親和素的96孔微孔板中分別加入100 μL不同濃度的核酸適配體，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干，采用酶標儀檢測其熒光強度。

1.2.3 互補序列濃度的優化 將互補序列用Tris-HCl 緩沖液稀釋成濃度分別為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1000 nmol/L，在上述優化的核酸適配體濃度反應后，洗滌，分別加入100 μL不同濃度的互補序列，37℃振蕩孵育30 min。用PBST清洗數次，扣干，采用酶標儀檢測其熒光強度。

1.2.4 標準曲線的建立 用甲醇溶解AFB1標準品，再用HEPES緩沖液 (pH 7.0，NaCl 120 mmol/L 、KCl 5 mmol/L 、MgCl220 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )將AFB1標準品溶液稀釋成濃度分別為0、0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的標準液。在包被鏈親和素的96孔微孔板中加入100 μL上述優化濃度的核酸適配體，25℃振蕩孵育30 min，PBST清洗3次，扣干；分別加入100 μL不同濃度的標準品溶液，37℃反應30 min后，用PBST清洗數次，扣干。再加入上述優化的互補序列，37℃反應30 min后，用PBST清洗數次，扣干。最后采用酶標儀檢測其熒光強度，根據標準品濃度與熒光值制定標準曲線。

1.2.5 交叉反應性分析 選擇AFB1的結構類似物AFB2、AFG1、AFG2及其他霉菌毒素CIT和OTA等作為標準品，溶解稀釋成1 ng/mL和10 ng/mL，按上述方法進行檢測。

1.2.6 飼料樣品檢測及加標回收率測定 從市場收集飼料樣品數個，準確稱取1.0 g樣品，加入10 mL甲醇進行提取，渦旋劇烈振蕩5 min，超聲提取30 min，濾紙過濾，收集濾液1。濾餅再用10 mL甲醇溶解后超聲提取，過濾后收集濾液2。合并2次收集的濾液，濃縮至盡干，加入HEPES緩沖液1 mL進行溶解后，采用上述方法檢測樣品中AFB1含量。選擇未檢出AFB1的飼料樣品進行加標回收率試驗，分別向1.0 g飼料樣品中添加AFB1標準品(標準品稀釋成液體后加入)，使樣品中含有1.0 ng/g、5.0 ng/g和10.0 ng/g AFB1，提取后采用建立的方法測定樣品的AFB1含量，計算飼料樣品的AFB1回收率。

2 結果與分析

2.1 鏈親和素包被的優化濃度

從圖1看出，隨著包被鏈親和素濃度的增大，熒光強度也隨之增加，當鏈親和素濃度達100 μg/mL時，熒光強度達檢測最大值，再增大鏈親和素濃度其熒光值不再增加，表明此時微孔上包被的鏈親和素已達飽和，因此鏈親和素濃度選擇100 μg/mL。

圖1 鏈親和素包被濃度的優化

2.2 核酸適配體的優化濃度

從圖2看出，隨著核酸適配體濃度的增大，熒光強度也隨之增加，當核酸適配體濃度達250 nmol/L時，熒光強度達最大值，表明核酸適配體上標記的生物素與包被于板上的鏈親和素已達平衡，再增大核酸適配體濃度，其熒光強度的變化不大，因此核酸適配體濃度選擇250 nmol/L。

圖2 核酸適配體濃度的優化

2.3 互補序列的優化濃度

從圖3看出，隨著互補序列濃度的增大，熒光值顯著降低，原因主要是互補序列與核酸適配體的結合使得其標記的BHQ1基團能有效地淬滅6-FAM基團的熒光，熒光強度隨著互補序列濃度的增大而降低，當互補序列濃度達500 nmol/L時，熒光值為1 500 a.u，濃度再增大熒光值變化不大，因此互補序列濃度選擇500 nmol/L。

圖3 互補序列濃度的優化

2.4 標準曲線

從圖4看出，AFB1濃度為0.01～10.0 ng/mL時有較好的線性關系，在此范圍內建立標準曲線，其標準方程為y= 4 625.3x+ 11 838(R2= 0.984 9)，最低檢測限為0.01 ng/mL。

從表1看出，建立的AFB1檢測方法除與AFB2有一定的交叉反應率外，最大交叉反應率為2.8%，與AFG1、AFG2、CIT和OTA的交叉反應率均低于0.7%，表明試驗建立的方法具有較好的特異性。

表1 AFB1檢測方法與結構相似物的交叉反應率

2.6 樣品中AFB1加標回收率

從表2看出，在飼料樣品中添加3個濃度AFB1標準品的回收率為91.3%～105.0%，回收率較高，表明建立的檢測方法具有較高的準確度，效果較好。

表2 飼料樣品中AFB1的加標回收率

3 討論

近年來，霉菌毒素對人和動植物造成的嚴重危害，廣泛引起政府和大眾對動植物食品安全衛生的高度關注。被霉菌毒素污染的飼料，嚴重影響動物生長和繁殖，同時會隨著食物鏈進入人體，進而造成一系列嚴重的健康問題。因此，食品質量安全也越來越引起人們的重視，建立快速、靈敏的霉菌毒素檢測方法是保障食品安全的重要手段。

核酸適配體指經體外篩選技術SELEX(指數富集配體系統進化)篩選出的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的寡聚核苷酸片段[9]。與基于抗體的酶聯免疫法相比，酶聯免疫法方法靈敏、快速、操作簡單，但會出現假陽性的現象，精確度有待提高[14]；而核酸適配體具有如抗體一樣的特性，對可結合的靶分子有嚴格的識別能力和高度親和力，建立的基于核酸適配體的檢測方法特異性好、靈敏度高。因此，近年來已報道了大量能特異性結合霉菌毒素的核酸適配體，也開發了基于核酸適配體檢測AFB1、AFB2和OTA等霉菌毒素的方法和生物傳感器[10]。如CASTILLO等[15]開發了一種基于核酸適配體檢測AFB1的電化學傳感器，檢測靈敏度及選擇性好，檢測限可達(0.40±0.03)nmol。班珺等[16]建立了一種基于AFB1與互補鏈競爭結合核酸適配體的位點使熒光恢復的轉換熒光法檢測AFB1的方法，檢測濃度范圍為1～300 ng/mL，檢出限為0.8 ng/mL，對花生、玉米樣品的回收率在81.1%～108.3%。金碧瑞等[17]建立了一種基于核酸適配體的上轉換熒光紙基傳感器測定茶水中AFB1的方法，檢測濃度范圍為0.1～100 ng/mL，最低檢出限為0.03 ng/mL，該方法靈敏度高、特異性強、適用于現場的快速檢測。在本研究中，在與AFB1具有高特異性結合的核酸適體末端標記熒光，利用其與AFB1特異性結合后空間構象的改變，與偶聯BHQ1的互補序列無法配對，導致熒光值變化而實現檢測，構建的方法快速、簡便、靈敏度高，可對飼料中的AFB1進行快速檢測。

4 結論

建立的基于核酸適配體檢測AFB1方法，快速、準確、靈敏度高，在優化條件下，檢測濃度范圍為0.01～10.0 ng/mL，最低檢測限可達0.01 ng/mL，與其他霉菌毒素的交叉反應率低，在飼料樣品中加標回收率高，可用于飼料中AFB1的分析檢測。