酒糟堆肥固氮微生物的篩選及性能研究

曾祥煉，席曉黎，吳耀領，王和玉，王 莉

(貴州茅臺酒股份有限公司技術中心，貴州 仁懷 564500)

0 引言

【研究意義】我國白酒年生產量大約為119.81億L，而2019年酒糟的排放量已達5 000萬t以上[1]。酒糟酸度大，水分含量50%以上，有機質含量高[2-4]，極易腐敗，不便存儲，若不及時處理，易對環境造成較大的污染，嚴重威脅釀酒企業的可持續發展。酒糟作為白酒生產的副產物，富含氨基酸、脂質、淀粉、纖維素和木質素等營養成分[5-6]，含有豐富的氮(3.5%)、磷(0.41%)等植物必需元素，重金屬含量、蛔蟲數、大腸桿菌、抗生素含量極少，是極好的有機肥源[7]。但目前有關接種固氮菌于白酒丟糟中生產高氮含量生物有機肥的研究相對較少，從白酒丟糟中篩選高效固氮能力菌株，對微生物肥料的研發具有現實重要意義。【前人研究進展】微生物肥料是一種無毒環保、環境友好型肥料，是農林業可持續發展的重要研究方向之一[8]。微生物肥料通過特定微生物的生命活動，使作物獲得養分供應，具有提高作物產量、影響種植土壤微生物結構、改善生態環境等多種功能[9]。相關研究發現，在高粱種植過程中施加氮肥和磷肥有助于高粱增產及籽粒支鏈淀粉的積累，而氮、磷、鉀肥不足均會造成高粱產量的下降，尤其以缺施氮肥最為顯著[10-12]，所以有機肥中氮素含量是其是否適于高粱地施用的重要考察指標之一。【研究切入點】目前已知的固氮細菌主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和聯合固氮菌3種類型。其中，共生固氮菌與聯合固氮菌因其對共生植物和生長環境要求嚴格，難以被廣泛應用，而自生固氮菌則是制造固氮微生物肥料主要菌種，但由于菌種類型和固氮能力強弱等原因，目前市場上銷售的微生物肥料產品質量差異較大[13-14]。因此，篩選高效固氮能力菌株，對研發微生物肥料提供菌種資源顯得尤為迫切。【擬解決的關鍵問題】以白酒丟糟為原料，利用高溫好氧堆肥富集優化微生物方式，從堆肥過程的中溫、高溫階段原位篩選具有固氮作用的菌株，并對其氨化性能和固氮能力進行研究，為制備高效固氮作用的復合微生物菌劑提供菌種資源和理論依據，以利于白酒丟糟堆肥的順利進行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 改良的阿須貝氏(Ashby)無氮瓊脂培養基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。改良的阿須貝氏(Ashby)無氮液體培養基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、蒸餾水1 000 mL。氨化微生物分離培養基(牛肉膏蛋白胨分離培養基)：牛肉膏3～5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20～30 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121℃蒸汽滅菌30 min。LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.4，121℃蒸汽滅菌30 min。YPD培養基：酵母膏5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g，pH自然，118℃蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 物化材料 鮮酒糟：含水量56.8%、全P 2.34 mg/g、全N 24 mg/g、有機質80.9%、 pH 3.6。風干酒糟：調節水分至50%～60%。新鮮稻草：粗纖維35.5%～45%、木質素21%～26%。以上材料均由貴州茅臺酒股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 氨化微生物的篩選

1) 氨化微生物的初次富集。將風干酒糟與新丟酒糟混合配制材料，風干酒糟占新丟糟重量的10%左右，利用風干酒糟調節堆糟水分含量為50%～60%。具體操作：堆體底部直徑2 m左右，堆體呈圓錐形，底鋪1層風干酒糟(厚約5 cm)，上鋪1層鮮酒糟(15～20 cm)，如此反復，至堆體高1.2 m左右完成堆砌。每3 d人工翻堆1次。堆肥48 h(堆體溫度55℃)完成微生物初次富集。

2) 氨化微生物的第2次富集。以初次富集的堆體酒糟作接種材料，新丟酒糟與初次富集的堆體酒糟按2︰1比例混合，并按混合后總重量的1%添加碎稻草，繼續富集并優化微生物，接種后4 d左右完成第2次富集。

3) 中溫微生物樣品采集。待第2次富集堆體平均溫度上升至60℃以上時，去掉堆體表層的結殼，在距離表面20 cm處(溫度約45℃)按東南西北4個方位分別取堆肥樣品，混合后進行中溫型微生物的分離和純化。

4) 高溫微生物樣品采集。待第2次富集堆體平均溫度上升至60℃以上，并持續6 d以上后，去掉堆體表層的結殼，在距離表面30 cm處(溫度>61℃)按東南西北4個方位分別取堆肥樣品，混合后進行高溫型微生物的分離和純化。

5) 氨化微生物的初步檢測。將分離純化后的微生物制備成菌懸液，用納氏試劑顯色法進行初步檢測，若出現紅棕色或黃色沉淀證明培養液中有氨化微生物。

1.2.2 微生物氨化能力測定 將上述篩選出的具有顯色反應的微生物菌株活化后，按4%體積比的菌液量接種到200 mL LB液體培養基或YPD液體培養基中，每株菌3個重復。然后置于恒溫搖床上120 r/min震蕩培養，分別在0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h用納氏試劑參照《水質銨的測定-納氏試劑比色法》(GB 7479-87)測定液體中氨態氮含量。并用SPSS對菌株氨態氮的生成率進行分析。

1.2.3 固氮作用考察 將初步篩選得到的菌株分別按5%的接種量(OD600約為1.0)接種于裝有100 mL改良的阿須貝氏無氮液體培養基的250 mL錐形瓶中，置于28℃、120 r/min培養3 d。以上每個步驟均設3個重復和1個空白對照，凱式定氮法測定固氮效能[15]。

1.2.4 菌株鑒定 將具有氨化作用和固氮性能的菌株保藏，并送中國科學院微生物研究所進行16S rRNA序列和ITS序列菌株鑒定及生理生化試驗。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS數據處理軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 篩選氨化微生物

2.1.1 微生物初步富集 堆肥24 h后溫度快速升高，48 h后達55℃以上并進入堆肥高溫期。堆肥初期微生物含量為：霉菌1×102CFU/g，細菌1×105CFU/g。至堆肥48 h時，完成微生物的初步富集，霉菌含量達1.2×106CFU/g，細菌含量達4.5×107CFU/g。初步堆肥后，微生物含量大幅增加，滿足作為第2次富集接種材料的要求。

2.1.2 中、高溫型堆肥酒糟微生物菌株 通過第2次富集試驗，完成對中、高溫型堆肥酒糟微生物的分離純化，初步獲得14株不同菌落形態的菌株。其中，中溫細菌有MX1、MX8、MX13、MX3和MJ1共5株，中溫霉菌有MM2、MM1和MM6共3株；高溫細菌有TX1、TX2和TX3共3株，高溫霉菌有TM2、TM1和TM3共3株。14株不同菌落形態的菌株在阿須貝培養基中生長良好。

2.1.3 具有氨化性能的菌株 根據菌株在阿須貝固態培養基上生長的菌落種類，通過微生物計數，選擇具有數量優勢的9株進行納氏顯色試驗，分別為4株中溫細菌MX1、MJ1、MX6和MX8，2株中溫霉菌MM2和MM6，1株中溫酵母MJ4，1株高溫霉菌TM1，1株高溫細菌TX1。根據納氏顯色試驗顯色圈直徑大小篩選出具有氨化性能的菌株5株，分別為MM6、MX8、MX1、TX1和MJ。從圖1看出，MM6、MX8、MX1、TX1和MJ菌株菌納氏試劑顯色后的顯色圈較大，可初步定性為具有氨化作用的菌株。

圖1 菌株的納氏試劑顯色圈直徑

2.2 菌株的氨化能力

從圖2可知，培養0～48 h，MM6、MX1和MX8株菌的氨態氮增長速率明顯高于TX1和MJ。培養48 h時，菌株MX8、MM6、MX1的氨態氮生成率分別為2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，且與TX1、MJ菌株在48 h時的生成率存在顯著性差異(P<0.05)，培養48～72 h 期間，MM6、MX1和MX8氨態氮生成率逐漸下降，TX1和MJ菌株氨態氮生成率緩慢增加；培養120 h，5株菌氨態氮的生成速率均接近0。表明，培養過程中菌株MM6、MX1和MX8具有較強的氨化作用。

圖2 菌株液態培養氨態氮的生成率

2.3 菌株的固氮性能

從圖3看出，對分離得到的5株菌在無氮液態培養基中培養3 d后，MX8菌株總氮含量為22.0 mg/L、MX1為15.8 mg/L，MX8、MX1菌株的固氮能力高于TX1、MM6和MJ菌株， MX8和MX1具備作為生產固氮微生物菌劑的潛力。

圖3 株菌在無氮液態培養基中培養3 d的總氮含量

2.4 菌株鑒定

對5株菌進行16SrRNA和gyrB基因序列鑒定，結果表明， MX8和TX1菌株同屬于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，MX1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，MJ為皺落假絲酵母(Candidarugosa)，MM6為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

根據理化試驗，MX8、MX1和TX1 3株細菌均為革蘭氏陽性菌，能產淀粉酶水解淀粉，產蛋白酶水解酪素，能夠還原硝酸鹽，可利用纖維二糖幫助纖維素降解；TX1和MX1菌株還能產果膠酶水解果膠；MX8和TX1不耐酸，pH 5.0下不能生長，屬于兼性厭氧菌；MX1菌株pH 5.0下能生長，屬好氧菌。MJ為皺落假絲酵母，可利用麥芽糖和可溶性淀粉，能同化纖維二糖，該菌不僅能在25℃下迅速生長，在37℃也能生長，用于固體酒糟堆肥能促進堆肥有機物降解，加快堆肥升溫；而MM6在生理生化特性方面不具備作為堆肥菌劑的潛能。

3 討論

氨化微生物能把培養基中的有機氮源經氧化、還原、轉化等步驟逐漸轉化為氨態氮。研究采用納氏試劑顯色法和阿須貝氏(Ashby)無氮培養法從白酒丟糟堆肥中篩選出5株具有氨化能力和固氮作用的菌株，分別為細菌MX8、TX1和MX1，酵母菌MJ，霉菌MM6。5株菌氨化試驗結果發現，培養48 h時，菌株MX8、MM6、MX1的氨態氮生成率分別為2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，具有較強的氨化作用。5株菌在無氮液態培養基中培養3 d后，菌株MX8、MX1總氮含量分別達22.0 mg/L、15.8 mg/L，固氮能力強。通過分子生物學鑒定及生理生化試驗表明，菌株MX8和TX1菌株同屬于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，MX1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，MJ為皺落假絲酵母(Candidarugosa)，MM6為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。生理生化試驗顯示，MX8、MX1和TX1株菌有一定的蛋白質、淀粉、纖維素、果膠等有機質的水解能力，MJ能同化纖維二糖，在固體酒糟堆肥過程中能促進有機質的降解，縮短腐熟進程，加快堆肥升溫。結合固氮能力的考察結果，確定MX8和MX1具備作為生產固氮微生物菌劑的潛能，但因試驗條件限制，還未對MX8和MX1進行大規模的固氮生產試驗，因此距投入實際生產應用還有一定距離。

4 結論

從白酒丟糟堆肥中篩選得到2株芽孢桿菌MX8和MX1，具有較高的固氮性能，具備作為生產固氮微生物丟糟肥料菌種的潛力。若通過一定規模生產試驗驗證其固氮性能，則可作為制備高效固氮作用的復合微生物菌劑的菌種資源應用于白酒丟糟堆肥，以加強白酒丟糟的有效利用，且緩解白酒丟糟造成的環境污染。