基于SLAF-seq技術的苗藥八爪金龍遺傳分析

劉暢 潘婕 劉雄偉 丁晶鑫 周英

摘 要： 為探究苗藥八爪金龍群體遺傳進化和親緣關系的遠近，該研究利用簡化基因組測序技術（SLAF-seq）對42份八爪金龍樣品進行測序，獲得多態性SLAF 標簽。同時采用GATK 和SAMtools軟件在多態性SLAF中檢測單核苷酸多態性（SNP）分子標記，并利用SNP分子標記分析八爪金龍樣品間的遺傳分化關系。結果表明：（1）42份八爪金龍共獲得246.35 Mb reads，測序質量值Q30 的平均值為95.66%，GC 含量的平均值為41.14%。（2）通過生物信息學的分析，獲得1 769 265個SLAF 標簽，其中379 829個多態性SLAF 標簽，共開發2 299 640個SNPs分子標記。（3）利用開發的SNPs數據構建八爪金龍的系統發育樹， 42份八爪金龍分成兩個大的類群。第一類群為細柄百兩和原變種百兩金;第二類群由貴州朱砂根、紅涼傘、湖北朱砂根和江西朱砂根組成。江西朱砂根與其余群體關系較遠，有明顯的分群現象。該研究從基因組水平揭示不同地區八爪金龍資源之間的遺傳關系，為八爪金龍種質資源的鑒定和遺傳多樣性分析提供了理論基礎，所開發的SNP 位點可進一步用于挖掘與品質、抗逆性等相關的基因。

關鍵詞： 八爪金龍， SLAF-seq， SNP， 遺傳進化， 親緣關系

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1145-10

Abstract： In order to explore the genetic evolution and relationship in Radix Ardisia， the 42 materials were used to sequencing base on specific loci amplified fragment sequencing （SLAF-seq）. Based on polymorphic SLAF tags， single nucleotide polymorphisms （SNPs） were identified by the GATK and SAMtools softwares， and to analysis the genetic differentiation. The results were as follows： （1） A total of 246.35 Mb reads data were obtained by SLAF-seq， the average of Q30 and GC content was 95.66% and 41.14%， respectively. （2） In total， 1 769 265 high quality SLAF tags were obtained， including 379 829 polymorphic SLAF tags， and a total of 2 299 640 SNPs were obtained. （3）Through the SNPs data， Radix Ardisia were divided into two groups. The first group contained BLX1-8 and BLY1-8， the second group contained ZSG1-8， HL， ZSH1-6 and ZSJ1-6. The results revealed the genetic relationships in the genomic level and provided theoretical basis for germplasm identification and genetic diversity analysis of Radix Ardisia and developed SNPs could be further used for excavating the gene related resistant， quality and so on.

Key words： Radix Ardisia， SLAF-seq， SNP， genetic evolution， genetic relationship

八爪金龍為貴州省苗族常用藥物，其藥用部位為根及根莖，具有清熱解毒、祛風除濕、散瘀止痛等功能，被苗族奉為喉科良藥，是苗藥驗方開喉劍噴霧劑（趙歐等，2016）和養陰口香合劑（吳筑華，2012）的主要成分。八爪金龍藥材來源多樣，其基原植物為紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）植物朱砂根（A. crenata）、紅涼傘（A. crenata var. bicolor）、百兩金（A. crispa）、大葉百兩金（A. crispa var. amplifolia）和細柄百兩金（A. crispa var. dielsii） （中國科學院中國植物志編輯委員會， 2002）。研究表明，不同來源的八爪金龍藥材化學成分存在差異，其主要成分巖白菜素的含量在不同來源的八爪金龍中存在差異，朱砂根中的皂苷數量遠遠豐富于百兩金（Liu et al.， 2016）;而百兩金中發現的4種黃酮類在朱砂根未被鑒定到（黃偉等，2010）。化學成分的形成與品質、產地、生態等密切相關，而化學成分決定其質量的好壞及其藥理作用。

八爪金龍資源主要以野生為主，其地理分布、生態環境、生長周期、采收與產地初加工存在的差異，為八爪金龍用藥準確及質量均一帶來了難題;其藥材使用比較混亂，也使得質量難以控制，嚴重影響其質量控制以及臨床使用的“療效同等性”。因此，建立有效的鑒定方法，對其遺傳結構進行深入分析，明確八爪金龍的起源和親緣關系，優選出質量較好且穩定的居群，保證其正確使用，對于規范八爪金龍流通和臨床有效利用具有重要的指導意義。目前主要的鑒別方法有性狀鑒別、顯微鑒別、DNA條形碼等（陳新蓮等，2017;陳文婷等，2020;潘婕等，2020），但這些方法具有片面性強或實驗過程復雜等缺點。高通量測序的技術，如簡化基因組測序（SLAF-seq）已經被運用于藥用植物的種質資源鑒定、遺傳定位分析、多態性分析、系統進化分析等（Liu et al.， 2016;Du et al.， 2019）。

本研究利用SLAF-seq技術對貴州、湖北、江西3個地點的42份八爪金龍種質資源進行測序，獲得SLAF多態性標簽，應用GATK 和SAMtools軟件對SNP 進行檢測。基于SNP分子標記，利用生物信息學進行系統進化樹、群體結構和PCA分析，從基因組水平揭示不同個體之間的遺傳分化關系，評估八爪金龍遺傳資源的親緣關系，為八爪金龍種質資源的鑒定和育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

42份八爪金龍種質資源來源于貴州、湖北和江西，其中貴州30份（8份原變種百兩金BLY、8份細柄百兩金BLX、8份朱砂根ZSG、6份紅涼傘HL），湖北恩施朱砂根ZSH 6份，江西武功山朱砂根ZSJ 6份，對葉片形態進行拍照觀察。具體分布地點如表1所示。

1.2 基因組DNA 的制備

取約40 mg八爪金龍葉片，用75%醫用酒精棉球擦拭葉片，將其剪碎后，加入液氮研磨，利用試劑盒提取八爪金龍基因組總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測八爪金龍基因組DNA的質量和濃度。

1.3 Illumina HiSeq 測序及產出數據的質量分析

由于八爪金龍目前尚無基因組序列信息發布，同時也無其近緣物種的基因組作參考，根據八爪金龍基因組的大小以及GC 含量等信息。選取水稻日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）參考基因組進行酶切預測，選擇最適酶切方案，以期獲得足夠標簽數的酶切片段（SLAF標簽）（Davey et al.， 2013）。選取HaeIII+ScaI-HF酶進行酶切，對質量合格的八爪金龍個體基因DNA 分別進行酶切。將酶切片段的3′端加A，加 Dual-index接頭（Kozich et al.， 2013），然后進行PCR擴增、純化、建庫，質檢合格的文庫，利用Illumina HiSeq 進行測序。

1.4 SLAF 標簽和SNP 標記的開發

利用Dual-index識別測序得到的原始數據，獲得樣品的reads，對低質量的reads及read接頭進行過濾，獲得高質量的reads。對高質量的reads進行聚類分析，聚在一起的為同一個SLAF 標簽，其不同個體間序列的差異為多態性SLAF 標簽。以測序深度最高的SLAF標簽序列作為參考序列，利用BWA軟件（Li et al.， 2009）將高質量的reads比對到參考基因組上，結合GATK（McKenna et al.， 2010）和SAMtools（Li et al.， 2009）軟件計算SNP分子標記，取兩個軟件的交集得到最終的SNP分子標記，MAF>0.05的SNP被認為是代表性的SNP。

1.5 遺傳結構分析

將具有代表性的高質量SNP使用MEGA X（Kumar et al.， 2018）軟件，基于鄰接法（neighbor-joining），采用Kimura 2-parameter模型，bootstrap重復1 000次，構建各樣品的系統發育樹。基于SNP數據，利用admixture軟件（Alexander et al.， 2009），分析樣品的群體結構，假設樣品的分群數（K值）為1～10，進行聚類分析，利用交叉驗證法驗證聚類結果，交叉驗證錯誤率最小時為最佳分群數。同時利用EIGENSOFT軟件（Price et al.， 2006），進行主成分分析（principal components analysis）（PCA），得到樣品的主成分聚類情況。

2 結果與分析

2.1 八爪金龍的形態特征

苗藥八爪金龍由朱砂根、紅涼傘、百兩金和細柄百兩金等的根莖加工而成。朱砂根（ZS）、紅涼傘（HL）、原變種百兩金（BLY）及細柄百兩金（BLX）在葉片形態上存在差異，細柄百兩金葉片較狹窄，朱砂根的葉片邊緣有齒，紅涼傘葉片背面是紅色的（圖1）。百兩金及其變種主要區別在于葉片長度及寬度。朱砂根變種紅涼傘的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色（圖1）。

2.2 建庫評估

利用SLAF-predict 軟件對八爪金龍基因組進行酶切方案預測，選擇HaeⅢ+ScaI-HF酶對八爪金龍基因組進行酶切，SLAF 標簽長度為414～464 bp，預測得到222 509個SLAF 標簽（表2）。將水稻日本晴的測序reads與其參考基因組進行比對，水稻日本晴雙端比對率為96.96%，酶切比例為95.79%（表3）。

2.3 測序數據統計與評估

經Illumina HiSeq 測序平臺進行測序，共獲得246.35 Mb reads，測序后各樣品的reads數目在1 491 644～11 923 328 bp 范圍內（圖2）。測序質量值Q30平均值為95.66%，測序堿基錯誤率低，所獲數據合格;測序獲得GC 含量平均值為41.14%，達到測序要求。

2.4 SLAF 標簽與SNP 標記的鑒定

通過序列分析，從42份八爪金龍中共獲得了1 769 265 個SLAF 標簽（表4）。標簽的平均測序深度為26.48，鑒定到379 829個多態性SLAF標簽，對多態性SLAF標簽進行分析，共開發得到2 299 640個SNP 位點（表4）。

2.5 系統發育分析

基于開發的2 299 640個SNP，采用 Kimura 2-parameter 模型，構建所有個體的 NJ 系統發育樹（圖3）。42份樣品可分成2 個大的類群，第一類群由細柄百兩金（BLX1-8）和原變種百兩金（BLY1-8），顯示它們之間有更近的親緣關系，細柄百兩金可能由原變種百兩金上溯而來。第二類群由貴州朱砂根（ZSG1-8）、紅涼傘（HL）、湖北朱砂根（ZSH1-6）和江西朱砂根（ZSJ1-6）組成，表明它們之間有較近的親緣，其分化有著明顯的地域特征。

2.6 遺傳結構分析

基于開發出的2 299 640個SNP 位點，通過admixture軟件分析群體結構。K 值為 1～10 的聚類情況（圖4）及各個 K 值對應的交叉驗證錯誤率（圖 5），交叉驗證錯誤率最小時為最優分群組。當 K=6時，交叉驗證錯誤率最小，因此最佳分群數為6，將42 份八爪金龍種質資源分為6個亞組，表明八爪金龍種間遺傳差異較大，形成明顯的種群遺傳分化。當K=2時，百兩金和朱砂根明顯分開;當K=3時，朱砂根、百兩金和江西武功山朱砂根區分開;當K=4時，將細柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根和貴州朱砂根區分開;當K=5時，將細柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根和湖北朱砂根區分開;當K=6時，將細柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根、湖北朱砂根區分開和紅涼傘區分開，但存在基因滲入的情況。

2.7 PCA分析

用EIGENSOFT軟件對2 299 640個SNP位點進行PCA分析，得到42份八爪金龍主成分聚類分析結果（圖6）。通過PCA 分析將個體聚為三維，PC1 代表第一主成分，PC2 代表第二主成分，PC3 代表第三主成分，且 PC1、PC2、PC3 的方差貢獻率分別為39.21%、18.58%、7.71%。從圖6可以看出，樣品間存在差異，來自同一地方的朱砂根/百兩金基本上聚在一起，說明它們之間的親緣關系比較近。圖中不同顏色表示所屬的群體，能夠反映個體的聚類情況，群體之間的距離能夠反映親緣關系的遠近。群體之間的距離越遠說明遺傳背景越遠，將 42 份材料大致分為 A、B、C、D 四組。A 組為原變種百兩金（除BLY1外）;B 組為細柄百兩金（除BLX5、BLX6、BLX8外）;C組為貴州朱砂根（ZSG1-8）、湖北朱砂根（ZSH）和紅涼傘（HL），說明這三個種或變種的遺傳背景差異較小;D 組為江西朱砂根（ZSJ1-6），與其余群體關系較遠，有明顯的分群現象。

3 討論與結論

近幾年，RAPD、ISSR 等分子標記已應用到八爪金龍種質資源的評價和遺傳分析，采用RAPD分子標記技術對朱砂根遺傳多樣性進行分析，朱砂根群體在DNA 水平上存在著豐富的遺傳多態性（江香梅等，2006）。駱亮等（2020）分析了20個朱砂根野生居群的255個樣品的遺傳多樣性，發現5條ISSR 引物共擴增出96條多態性條帶。但由于八爪金龍無參考基因組，常規方法開發的特異分子標記數量不多。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是一種較為有效的分子標記（Liu et al.， 2012），可用于動植物的群體遺傳和進化關系研究。趙俊生等（2016）利用SNP分子標記分析化橘紅的種質資源，從中篩選出21個多態性SNP位點，為化橘紅種質資源鑒定提供了有效的分子標記。孫清明等（2013）利用SNP分子標記對363份荔枝種質資源進行親緣關系鑒定，為荔枝新種質的親本來源鑒定提供分子標記。

簡化基因組測序（SLAF-seq ）技術能夠在無參基因組物種中實現SNP特異性分子標記開發，可用于植物遺傳多樣性的研究。有研究利用SLAF-seq 技術已經構建了枸杞果實和葉片性狀的SNP高密度遺傳圖譜（Zhao et al.， 2019）和丹參高密度遺傳連鎖圖（Liu et al.， 2016）。Du et al.（2019）采用SLAF-seq方法，對7個中國本地山楂屬植物和2個歐洲、1個北美外來山楂屬植物的53個家系進行了分析，共鑒定出933 450個SNP，用于物種基因組進化研究。姜濤等（2020）利用SLAF-seq測序技術對39份連翹種質資源遺傳多樣性和SNP分子標記進行研究，共獲得180 974 1個SNP分子標記，將連翹資源分為4組，為其遺傳結構分類提供新的信息。唐曉敏等（2020）利用SLAF-seq 技術對廣金錢草樣品進行測序，開發得到SNP多態標記220 704個，為種質保護和遺傳改良提供參考。本研究利用SLAF-seq 技術對42份八爪金龍種質資源進行測序，共開發得到2 299 640個SNP位點，為后期八爪金龍特異性SNP開發提供基礎，同時為八爪金龍遺傳育種改良，提高育種效率提供數據參考。

植物的生長環境、地理位置、海拔高度對物種的遺傳分化和種群結構能夠產生影響。地理分布和海拔高度的差異影響浙江產車前草種群的遺傳分化（郭水良等，2002）。不同地理位置的廣金錢草種源間存在一定的遺傳分化（唐曉敏等，2020）。系統發育樹主要是描述物種之間的分類學和進化關系以及具有共同祖先的物種之間的進化關系的樹形圖（韓鳳俠等，2008）。本研究構建了42份八爪金龍樣品的系統發育樹，系統發育樹可以將百兩金和朱砂根區分開。課題組前期對八爪金龍基原植物DNA 條型碼進行篩選，ITS 序列能區別百兩金和朱砂根，但無法區分朱砂根和紅涼傘（潘婕等，2020）。因此，百兩金和朱砂根親緣關系較遠，化學成分存在差異，需進一步明確其藥理作用的差異，保證其正確使用。

葉片形態表明，貴州朱砂根和湖北恩施州朱砂根葉片形態相近，而與江西武功山朱砂根葉片形態差距較大。系統發育樹結果表明，貴州朱砂根和湖北恩施州朱砂根親緣關系較近，與江西武功山朱砂根關系較遠;紅涼傘與貴州的朱砂根和湖北恩施州的朱砂根親緣關系較近。貴州和湖北恩施州同屬苗族聚集區，江西武功山與貴州和湖北恩施州在人為環境和地理環境方面存在差異。因此，江西武功山朱砂根種源在進化過程中受到了人文環境、地理環境隔離的影響，與貴州、湖北恩施州的朱砂根種源基因交流較少，逐漸出現分化。

朱砂根和紅涼傘葉片形態相近，但紅涼傘的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色，DNA條形碼無法區分朱砂根和紅涼傘（陳新蓮等，2017;潘婕等，2020）。當K=6 時的群體遺傳結構分析表明，將細柄百兩金、原變種百兩金、江西武功山朱砂根、貴州朱砂根、湖北朱砂根和紅涼傘區分開，說明八爪金龍種源間存在一定的遺傳分化。基于SNP的分子標記，能夠區分紅涼傘和朱砂根，因此，我們將進一步開發紅涼傘和朱砂根特異的SNP分子標記。

基于SNP 標記構建的系統發生樹為研究八爪金龍品種之間親緣關系提供了證據，雖然八爪金龍野生種可能具有相似的起源種，但在演化過程中逐漸出現分化;同時本研究開發的SNP 位點為后續八爪金龍品種間共有或特異性標記的開發提供基礎，理清歸納八爪金龍品種間生物學特征。

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（責任編輯 周翠鳴）