HPLC法測定大果山楂果實中八種酚酸類成分的含量

孫博 霍華珍 蔡愛華 謝運昌 李海云 李典鵬

摘 要： 建立HPLC法同時測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、p-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的方法，并通過HPLC法分析這八種酚酸在不同產地大果山楂果實中的含量。采用ZORBAX SB-C18色譜柱，以甲醇/1.5%甲酸水溶液（v/v）為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長280、320 nm。結果表明：（1）在線性范圍內八種酚酸質量濃度與色譜峰峰面積的線性關系良好，相關系數均>0.997，檢出限0.08～0.20 μg·mL-1，定量下限 0.27～0.67 μg·mL-1，變異系數均<5.0%，加標回收率99.3%～103.3%;（2）10個不同產地的大果山楂果實中酚酸含量豐富，均檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，其中，二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸均為首次檢出，以綠原酸為主（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸的80%以上，總酚酸的質量分數在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，其中廣西百色靖西和桂林恭城產的果實總酚酸質量分數相對較高，均大于15 000 μg·g-1。綜上結果表明，該研究的HPLC法適用于大果山楂果實中酚酸含量的測定，可為大果山楂優良品種的選育、產品質量控制及深度開發利用提供方法和科學參考。

關鍵詞： HPLC， 大果山楂， 果實， 酚酸， 含量

中圖分類號： Q946 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1135-10

Abstract： The contents of phenolic acids in Malus doumeri fruits from different production areas were investigated， and at the same time， HPLC method was developed to detect eight phenolic acids， including protocatechuic acid， chlorogenic acid， dihydrocaffeic acid， caffeic acid， phloretic acid， p-coumaric acid， ferulic acid and cinnamic acid. ZORBAX SB-C18 column was adopted. The mobile phase was composed of methanol and 1.5% formic acid aqueous with a gradient elution. The column temperature was 35 ℃， the flow rate was 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 280， 320 nm， and the injection volume was 20 μL. The results were as follows： （1） Linear relationship between the mass concentration and the peak area of the chromatogram of eight phenolic acids good， with the correlation coefficient > 0.997， the detection limit 0.08-0.20 μg·mL-1， the lower limit of quantitation 0.27-0.67 μg·mL-1， the coefficient of variation <5.0%， and the adding standard recovery 99.3%-103.3%. （2） Seven phenolic acids （protocatechuic acid， chlorogenic acid， dihydrocaffeic acid， caffeic acid， phloretic acid， ferulic acid and cinnamic acid） were detected over ten samples in different production areas. Among the seven phenolic acids， dihydrocaffeic acid， phloretic acid and ferulic acid were detected in M. doumeri fruits for the first time， and chlorogenic acid （8 410.2-13 826.7 μg·g-1） was predominant， accounting for more than 80% of the total phenolic acids. The mass fraction of total phenolic acids ranged from 10 187.8 to 15 583.9 μg·g-1. The mass fraction of total phenolic acids from fruits picked from Jingxi of Baise and Gongcheng of Guilin in Guangxi was relatively high， more than 15 000 μg·g-1. The above results indicate that the HPLC method used in this study is suitable for the determination of phenolic acids contents in M. doumeri fruit， and can provide methods and scientific basis for screening superior variety， products quality control， and deep exploitation and utilization of M. doumeri fruits.

Key words： HPLC， Malus doumeri， fruits， phenolic acids， content

大果山楂，又名澀梨、廣山楂等，為薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus Mill.）植物臺灣林檎（M. doumeri ）或光萼林檎（M. leiocalyca ）的果實，主要分布于中國南部廣西、福建、臺灣等地，廣西逐步成為大果山楂臺灣林檎人工栽培主產區（王雷宏等，2012;曾勇豪等，2014;黃欣欣，2015）。大果山楂含有豐富的營養成分和活性成分，具有降脂、保肝和抗腫瘤等生理功效（Zhu et al.， 2019;趙帥等，2020），是廣西道地藥材之一（鄧家剛和韋松基，2007），為壯藥，其果實酸甜，可加工成果糕、果酒等地方特色食品，具有廣闊的開發利用前景（廣西壯族自治區食品藥品監督管理局，2011;張巧等，2018;郭婷等，2019）。但大果山楂物質基礎研究不夠深入，缺乏科學、合理的質量評價方法，阻礙了其深度開發和利用（溫玲蓉，2016;趙帥等，2020）。

酚酸類化合物是含有活潑氫供體結構的酚羥基有機酸，具有抗氧化、抗菌和抗病毒等多種生物活性，是大果山楂果實中重要的功效成分之一（溫玲蓉，2016;Choi et al.， 2017;陳志杰等，2018），定性定量分析大果山楂果實的酚酸類組成及含量對評價果實的品質并促進其深度加工利用具有重要意義。現有多種分析酚酸類化合物的方法，而高效液相色譜法（HPLC）因具有準確度高、經濟簡便等優點被檢測領域廣泛使用（李巖等，2018;鄧渝等，2018;屈艷勤等，2019）。目前，對大果山楂果實中酚酸類成分進行定性定量分析的報道較少，僅有Wen et al.（2016）采用HPLC法測定了果實中綠原酸、咖啡酸、肉桂酸三種酚酸的含量，且分離效果仍有待改進。本研究建立HPLC法同時測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、p-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的方法，并比較分析這八種酚酸在不同產地大果山楂果實中的含量，以期為大果山楂優良品種的選育、原料和產品的質量控制以及深度開發和利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大果山楂樣品采自10個不同產地的新鮮果，經廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所李典鵬研究員和黃渝松副研究員鑒定，均為臺灣林檎（Malus doumeri） 果實，具體見表1。選擇無病蟲害、無機械損傷且成熟度基本一致的樣品，在溫度4 ℃、濕度78%左右環境中貯藏。

原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸對照品（純度≥98%），西安玉泉生物科技有限公司;甲醇、乙腈（色譜純），安徽天地高純溶劑有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、甲酸（AR），西隴化工股份有限公司;乙酸乙酯、乙醚（AR），天津市大茂化學試劑廠;EDTA、抗壞血酸（AR），國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

1.2 儀器和設備

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（配有Prominence SPD-M20A PDA檢測器），日本島津公司;高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;真空冷凍干燥機，上海喬楓實業有限公司;RIOS 8超純水系統，美國Millipore公司;XS205DU電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司;F-020ST數控超聲波清洗機，深圳福洋科技集團有限公司;LHS智能恒溫恒濕箱，上海一恒科學儀器有限公司;N-1100旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社;BCD-213D11D雙門冰箱，廣東容聲電器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 1.5%甲酸水溶液的配制：取15.0 mL甲酸，超純水定容至1.0 L，用0.45 μm水相膜過濾，超聲5 min，現配現用。酚酸單一對照品儲備液的配制：分別精確稱取20.0 mg的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸對照品，置于25 mL 棕色容量瓶中，并用色譜甲醇溶解后定容至刻度，得到800.0 μg·mL-1的單一對照品儲備液，置于-20 ℃冰箱中避光保存備用。樣品稀釋液的配制：取1.5%甲酸水溶液95 mL，加入5 mL色譜甲醇，混勻，現配現用。混合酚酸對照品工作液的配制：等量移取8種單一對照品儲備液，充分混勻后，用樣品稀釋液稀釋至0.05～100 μg·mL-1的系列混合酚酸對照品溶液，過0.45 μm有機濾膜，超聲脫氣5 s，現配現用。堿提取液：分別先配成4 mol·L-1 NaOH、1%抗壞血酸和10 mmol·L-1 EDTA 溶液，將三者按120∶2∶3的比例添加后混勻;萃取液：乙醚和乙酸乙酯按體積比1∶1混勻即可。

1.3.2 大果山楂果實總酚酸的提取及分析前樣品預處理

1.3.2.1 總酚酸的提取 參照文獻方法（Luo et al.， 2013; 李巖等，2018;匡鳳元等，2019），稍作改進。將新鮮的大果山楂果實切成小塊，凍干磨成粉。酚酸有機溶劑提取：稱取粉末樣品2.000 g，加入80%甲醇水溶液40 mL，常溫浸提24 h，40 ℃超聲提取 30 min，過濾，10 000 r·min-1 離心 5 min，濾渣重復提取2次，合并上清液得到A提取液。堿提取：將上述過濾得到的殘渣和離心得到的沉淀合并后加入50 mL堿提取液，在氮氣保護并密封條件下室溫攪拌約24 h，用HCl調節pH為2.0，用60 mL萃取液萃取三次，合并萃取液10 000 r·min-1 離心5 min，得到B提取液。酸提取：繼續將上述堿處理過的殘渣和沉淀在85 ℃下用50 mL HCl（4 mol·L-1）水解30 min，冷卻后用NaOH調節pH為2.0，其余同堿提取方法，得到C提取液。合并A、B、C三種提取液即為總酚酸提取液。

1.3.2.2 分析前樣品預處理 將1.3.2.1得到的總酚酸提取液50 ℃真空旋蒸干，用色譜甲醇溶解并定容至25.0 mL，進樣前用樣品稀釋液稀釋至標準曲線線性范圍內的濃度，10 000 r·min-1離心5 min，過0.45 μm有機濾膜備用。

1.3.3 色譜條件優化及系統適應性試驗 ?檢測波長：取八種酚酸對照品儲備液各50 μL，單獨稀釋成80.0 μg·mL-1，分別在波長190～400 nm之間掃描紫外光譜，選擇有較大吸收且無溶劑干擾的波長作為檢測波長。色譜柱：選用四種不同填料的反相色譜柱（Symmetry C18、Atlantis T3、BEH C18和ZORBAX SB-C18），分析80.0 μg·mL-1的混合酚酸對照品工作液，選擇分離度和峰型相對較好的色譜柱。流動相及檢測條件：以甲醇-水溶液或乙腈-水溶液為流動相，改變水溶液的酸種類和濃度、梯度洗脫程序、柱溫和流速，以對照品各色譜峰之間的分離度、樣品中主要目標組分的理論塔板數以及樣品中目標組分與干擾峰的分離效果評價系統適應性，并確定較優的色譜條件。

1.3.4 方法學驗證方法

1.3.4.1 線性關系和靈敏度試驗 將混合酚酸對照品工作液按1.3.3優化的色譜條件進行檢測，以色譜峰面積為縱坐標（y），質量濃度為橫坐標（x）繪制八種酚酸的標準曲線確定線性方程和線性范圍，以信噪比（S/N）為3時，確定檢出限（LOD），S/N為10時，確定定量下限（LOQ）（陳丹丹等，2019），重復6次。

1.3.4.2 精密度試驗 精密吸取40.0 μg·mL-1混合酚酸對照品工作液，處理方法同1.3.4.1，連續進樣檢測6次，以色譜峰面積計算每個酚酸的變異系數（RSD）值。

1.3.4.3 穩定性試驗 移取5.0、20.0、60.0 μg·mL-1混合酚酸對照品工作液，處理方法同1.3.4.1，在1 d內進樣檢測6次，時間間隔4 h;在6 d內，每日同一時間點進樣1次。按照1.3.4.2方法計算每個酚酸日內和日間的RSD值。

1.3.4.4 重復性試驗 精密稱取1.3.2.1方法制備的大果山楂凍干粉2.000 g，共6份，分別按1.3.2的方法提取酚酸并進行樣品預處理，進樣檢測，按照1.3.4.2方法計算每個酚酸的RSD值。

1.3.4.5 加標回收率的測定 精密稱取1.3.2.1方法制備的大果山楂凍干粉1.000 g，以原有目標化合物量的150%、100%、50%加入8個酚酸對照品溶液，按照1.3.2的方法提取酚酸并進行樣品預處理，進樣檢測，重復3次，將得到的色譜峰面積代入線性方程，根據樣品和加標樣品的濃度計算每個酚酸的加標回收率和RSD值。

1.3.4.6 樣品色譜圖分析 移取1.3.2.2制備的樣品進行檢測，比較單一對照品的保留時間并結合相應的紫外光譜對樣品中目標組分進行定性，根據標準曲線和峰面積計算對應樣品中每個酚酸的含量，重復6次。

1.4 數據處理

采用Excel 2019軟件進行數據處理，SPSS 23.0軟件對數據進行差異性分析（ANOVA），Adobe Photoshop cc 2019軟件對圖像進行處理。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 酚酸單一對照品紫外掃描的結果表明：原兒茶酸、二氫咖啡酸、根皮酸和肉桂酸在280 nm附近有最大吸收峰;綠原酸、咖啡酸、p-香豆酸和阿魏酸在320 nm附近有最大吸收峰。因此，選擇280、320 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜條件優化結果及對照品和樣品色譜圖分析 色譜柱是HPLC檢測分析的核心部件，其性能發揮受到分析樣品的化學組成和理化性質的影響（李旻昊等，2019）。四種反相色譜柱研究結果表明，ZORBAX SB-C18色譜柱在同一分析條件下目標組分峰形相對較好，因此，選擇該色譜柱用于本實驗后續進一步的研究。流動相是影響HPLC分離效果的重要因素，甲醇-水溶液或乙腈-水溶液是酚酸類成分分析采用較多的流動相，在水溶液中添加適量濃度的酸對改善樣品的分離度和峰形有明顯的效果，甲酸或乙酸比較常用（王曉梅等，2016;鄧寶安等，2017;李巖等，2018;鄧渝等，2018;匡鳳元等，2019;屈艷勤等，2019）。比較甲醇、乙腈、甲酸水溶液和乙酸水溶液對目標組分的分離效果，結果表明：以0.1%乙酸水溶液為流動相時，甲醇和乙腈的分離效果均不理想，綠原酸和二氫咖啡酸大部分重疊，而以0.1%甲酸水溶液為流動相時，甲醇和乙腈均能改善綠原酸和二氫咖啡酸的分離效果，兩者的分離度分別為1.0和0.8，甲醇稍優于乙腈，但隨著綠原酸和二氫咖啡酸的分離，相鄰咖啡酸與二氫咖啡酸的分離度只能達到1.2。以甲醇為流動相，進一步研究不同濃度的甲酸水溶液對目標組分分離效果的影響，當甲酸水溶液為1.0%時，八種對照品酚酸之間的分離度可達到1.5，基線平穩且色譜峰峰形較好，因此，選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相。

準確地對目標成分進行定性和定量分析，不僅對照品的分離度需要滿足要求，也需考慮樣品中的目標成分是否與干擾峰實現到有效分離。大果山楂酚酸樣品提取過程中不可避免會帶入其他黃酮類成分，研究發現，阿魏酸、肉桂酸與大果山楂中的黃酮糖苷出峰時間很容易重合或非常接近，進一步調整流動相組成、柱溫和流速等參數，結果顯示提高流動相水溶液中的酸濃度和柱溫可顯著改善樣品的酚酸與黃酮糖苷的分離效果。綜合考慮色譜柱的使用壽命和樣品的分離效果，優化后的色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）;流動相為1.5%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序（0～25 min，10%～35% B;25～45 min，35%～45% B;45～48 min，45% B）;柱溫35 ℃;流速1.0 mL·min-1;進樣量20 μL。

采用以上優化的色譜條件進行液相分析，混合酚酸對照品及大果山楂果實酚酸提取物樣品的色譜圖見圖1，八種酚酸的保留時間分別為原兒茶酸9.6 min、綠原酸14.6 min、二氫咖啡酸16.0 min、咖啡酸17.9 min、根皮酸22.7 min、p-香豆酸25.0 min、阿魏酸27.8 min、肉桂酸45.1 min，各酚酸之間的色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數以樣品中的主成分綠原酸色譜峰計算大于3 000，基線平整，峰形好，表明本檢測分析方法可以對大果山楂果實中的八種酚酸類成分進行定性與定量分析。1. 原兒茶酸; 2. 綠原酸; 3. 二氫咖啡酸; 4.咖啡酸; 5. 根皮酸; 6. p-香豆酸; 7. 阿魏酸; 8. 肉桂酸。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 線性關系、檢出限及定量下限 從表2中可以看出，八種酚酸對照品在線性范圍內均呈現良好的線性關系，相關系數0.997 7～0.999 5，檢出限 0.08～0.20 μg·mL-1，定量下限0.27～0.67 μg·mL-1，表明本方法檢測靈敏度較高，能夠實現樣品中低濃度酚酸的定量分析。

2.2.2 精密度測定 同一樣品連續進樣得到的峰面積越接近，說明儀器的精密度越好，試驗結果越精準。本方法的精密度試驗顯示酚酸對照品的RSD值分別為原兒茶酸1.07%、綠原酸1.11%、二氫咖啡酸2.59%、咖啡酸2.14%、根皮酸0.85%、p-香豆酸2.60%、阿魏酸2.11%、肉桂酸1.46%，最大的變異系數為2.59%，表明精密度良好，符合測定要求。

2.2.3 穩定性測定 樣品在放置的時間段內，測得的峰面積變化越小，說明樣品越穩定，試驗結果則越準確。本方法不同濃度對照品的日內和日間穩定性測定結果如表3所示，各種酚酸在日內的變異系數均小于4.62%， 日間的變異系數均小于4.99%，表明對照品日間和日內的穩定性良好，符合穩定性要求。

2.2.4 重復性測定 同樣的大果山楂樣品進行酚酸提取和預處理，測得的峰面積越接近，表明試驗在操作過程中出現的誤差越小，試驗結果則越準確。本研究方法的重復性試驗顯示樣品中各個酚酸的RSD值分別為原兒茶酸3.16%、綠原酸1.19%、二氫咖啡酸3.37%、咖啡酸1.48%、根皮酸3.08%、p-香豆酸1.71%、阿魏酸1.96%、肉桂酸2.09%，最大的變異系數為3.37%，表明該方法的重復性較好，符合實驗要求。

2.2.5 加標回收率的測定 本方法大果山楂果實樣品加標回收率結果如表4所示，八種酚酸的平均加標回收率在99.3%～103.3%之間，RSD值均小于3.45%，表明該方法準確度良好，可以用于對大果山楂果實酚酸含量的檢測。

2.3 不同產地大果山楂果實酚酸含量的比較分析

10個不同產地大果山楂果實中測定的八種酚酸含量見表5，樣品中均檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，其中二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸在大果山楂果實中首次檢出（趙帥等，2020），p-香豆酸雖存在于大果山楂葉中（Zhao et al.， 2015），但本研究的所有樣本中均未檢出，表明果實中可能不存在這種酚酸或含量極其微量，不在檢測范圍內。進一步的單因素方差分析可知，不同產地果實的酚酸總含量以及各酚酸之間的含量均存在明顯差異，七種酚酸總含量在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，綠原酸均為最主要的酚酸類成分（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸80%以上，廣西百色靖西和桂林恭城產的果實，其總酚酸和綠原酸含量相對較高，分別大于15 000、13 500 μg·g-1;其余六種酚酸含量都遠低于綠原酸，分別為咖啡酸471.6～850.5 μg·g-1、原兒茶酸184.3～487.8 μg·g-1、二氫咖啡酸102.6～391.5 μg·g-1、肉桂酸81.2～520.1 μg·g-1、阿魏酸57.8～423.4 μg·g-1、根皮酸24.2～230.8 μg·g-1，根皮酸為含量相對較少的酚酸成分，整體水平最低。以上結果表明，大果山楂果實中酚酸類成分種類和含量豐富，這為今后對大果山楂果實的開發利用提供了方向和依據。

3 討論與結論

本文建立了HPLC法測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸的方法，該方法不僅可以實現同時檢測這八種酚酸，而且與以往三種酚酸的檢測方法相比（Wen et al.， 2016），酚酸之間分離度好，酚酸與干擾峰之間得到有效分離， 基線平整，準確度、靈敏度和精密度高，重復性和穩定性好，符合檢測分析的要求，因此定性和定量更為準確。色譜條件為ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），以甲醇/1.5%甲酸水溶液（v/v）為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長280、320 nm，進樣量20 μL。

大果山楂果實中酚酸組成和含量豐富，共檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸在大果山楂果實中首次檢出;果實中總酚酸及酚酸之間的含量差異明顯，七種酚酸總的質量分數在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，以綠原酸為主（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸的80%以上，廣西百色靖西和桂林恭城的果實總酚酸和綠原酸質量分數均相對較高，分別大于15 000、13 500 μg·g-1，綠原酸含量為同屬植物蘋果的3～180倍（Feliciano et al.， 2010; 李鑫，2015;韓明虎等，2018），在后續的品種選育、原料選擇和加工利用方面值得關注。

酚酸類化合物是高等植物中普遍存在的一類次生代謝產物，也是合成木質素的中間產物（陳志杰等，2018;高媛等，2018），果實中的酚酸組成和含量除了與品種、產地有關外，也與果實采摘時的成熟度和貯藏條件等密切相關（Seraglio et al.， 2018; 匡鳳元等，2019），進一步研究不同時期酚酸類成分的變化規律更有利于準確評估不同產地大果山楂果實中的酚酸類組成和含量。本研究結果能為以上這些后續研究提供檢測方法和研究方向。

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（責任編輯 李 莉）