泡菜直投菌對小鼠腸道菌群失調的修復效果

肖冠坤，郭佳汶，程如越，彭天宇，李毓萍，陳書巧，陳功，張其圣，李鳴*

（1.四川大學華西公共衛(wèi)生學院，華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，四川 成都 611130；3.四川東坡中國泡菜產業(yè)技術研究院，四川 眉山 620010）

在腸道內定植的數量龐大、組成復雜的腸道菌群是腸道微環(huán)境和機體的重要組成部分[1-2]。腸道菌群與機體互利共生，腸道提供了恒溫且富含營養(yǎng)的生存環(huán)境，腸道菌群則具有調節(jié)腸道運動和分泌、參與營養(yǎng)物質消化吸收、構成腸道上皮生物屏障、調節(jié)免疫系統(tǒng)等生理功能[2-4]。正常情況下，腸道菌群與機體保持動態(tài)平衡，其豐度和多樣性受到種族、年齡、飲食、生活方式、益生菌、運動、藥物、疾病等多種因素的影響，其中最常見的影響腸道菌群的藥物是抗菌藥物，尤其是廣譜抗菌藥物[2-3]。

抗生素是人類抵御細菌感染的重要手段[5]。近年來，抗生素濫用導致細菌耐藥性和人體不良反應的發(fā)生率大大增加，破壞腸道微生態(tài)平衡，引起腸道菌群紊亂，增加慢性病的發(fā)病風險，嚴重威脅人類健康[5-6]。益生菌因其具有調節(jié)腸道菌群和拮抗有害微生物定植的生理作用，常被作為抗生素的替代或輔助治療物[6-7]。

泡菜是我國食用廣泛、歷史悠久的發(fā)酵食品，富含以乳酸菌為主的有益菌群[8-9]。泡菜直投菌（direct vat set Lactobacillus，DVSL）是從四川泡菜中提取的植物乳桿菌，安全性較高，耐酸耐膽鹽性能優(yōu)良，能在人體腸道中定植，具有促進營養(yǎng)物質消化吸收、維持腸道菌群平衡、改善腸道功能、降低膽固醇等作用[8-11]。

本研究通過建立抗生素誘導的腸道菌群失調小鼠模型，觀察抗生素對腸道菌群和生長發(fā)育的影響，探究泡菜直投菌對抗生素誘導的小鼠腸道菌群失調的修復效果及其對機體的影響，為泡菜直投菌的腸道功能改善和腸道菌群調節(jié)作用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼養(yǎng)

36只四周齡SPF級BALB/c雄性小鼠：四川省人民醫(yī)院（四川省醫(yī)學科學院）實驗動物研究所，動物合格證號SCXK（川）2013-15。飼養(yǎng)于四川大學華西公共衛(wèi)生學院動物實驗中心IVC系統(tǒng)，室溫（23±1）℃，濕度50%～70%，自由飲食，12 h晝夜節(jié)律。

1.1.2 試劑與材料

頭孢曲松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泡菜直投菌菌粉（植物乳桿菌pc170株，活性量108CFU/g）：四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院；無水乙醇：成都金山化學試劑有限公司；RT-PCR反應系列試劑：伯樂生命醫(yī)學產品上海有限公司（BIO-RAD）；糞便細菌DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；糞便16S rRNA V6-V8區(qū)引物（U968F：5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'和L1401R：5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'）、16S rRNA V3-V4 區(qū)引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組

36只四周齡BALB/c雄性小鼠隨機分為對照組（control group，Ctrl）、抗生素組（antibiotics exposure group，Abx）、泡菜直投菌組（PC），每組 12 只，單只分籠喂養(yǎng)。

1.2.2 灌胃

第1周Ctrl組小鼠0.2 mL生理鹽水灌胃，Abx組和PC組0.2 mL頭孢曲松（40 mg/d）灌胃，間隔2 h后，PC組0.2 mL泡菜直投菌（109CFU/d）灌胃，Abx組和Ctrl組0.2 mL生理鹽水灌胃。第2至4周PC組小鼠0.2 mL泡菜直投菌（109CFU/d）灌胃，其余兩組0.2 mL生理鹽水灌胃。

1.2.3 稱重及計算臟器指數

灌胃期間每3 d稱重，記錄結果。灌胃第28天處死小鼠并采集樣品，稱量臟器質量，計算臟器指數。

1.2.4 糞便DNA提取及細菌定量

每周采集糞便，-80℃凍存。嚴格遵照糞便基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便DNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）測定小鼠糞便細菌總量，反應條件：95℃預熱 1 min，94℃解鏈 20 s，55℃退火20 s，72℃延伸50 s，共40個循環(huán)。根據大腸桿菌標準曲線計算糞便樣品細菌濃度。

1.2.5 二代測序

1.2.5.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用溴化十六烷基三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）方法提取樣本基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量樣本DNA于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物、含GC緩沖液的高保真PCR混合物和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。

16S V4區(qū)引物（515F和806R）用于鑒定細菌多樣性；18S V4區(qū)引物（528F和706R）用于鑒定真核微生物多樣性；ITS1區(qū)引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）用于鑒定真菌多樣性；此外，擴增區(qū)域還包括：16S V3-V4區(qū)、V4-V5區(qū)，古菌16S V4區(qū)、V4-V8區(qū)，18S V9區(qū)以及ITS2區(qū)。

1.2.5.2 PCR產物的混樣和純化

根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.2.5.3 文庫構建和上機測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.6 組織病理學檢測

灌胃第28天處死小鼠，以盲腸為界收集小鼠結腸及回腸各約1 cm，10%甲醛固定后做組織切片，蘇木精-伊紅染色觀察回腸及結腸結構。應用Image-Pro Plus 6.0以右下角100倍標尺為標準，每張切片選取5根完整絨毛，測量絨毛高度（mm）、腸腺深度（mm），作統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數據采用Microsoft Office Excel 2010建立數據庫，SPSS 22.0進行數據分析，數據結果以±S表示，符合參數檢驗條件的數據，多組間比較采用方差分析和Dunnett-t檢驗，體重采用重復測量資料的方差分析；不符合參數檢驗條件的數據，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 小鼠機體一般情況

2.1.1 體重

實驗期間小鼠體重變化情況見圖1。

圖1 實驗期間小鼠體重變化情況Fig.1 Body weight of mice during the experiment

如圖1所示，整個試驗期間3組小鼠體重不同（F=5.32，P＜0.01），且3組小鼠體重隨時間變化的趨勢不同（F=4.19，P＜0.01）。從第 3天開始，Abx組、PC 組小鼠體重顯著低于Ctrl組（P＜0.05），PC組和Abx組小鼠體重分別自灌胃第18天和第21天與Ctrl組無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.2 肝臟質量和肝臟指數

小鼠肝臟質量和肝臟指數見表1。

表1 小鼠肝臟質量和肝臟指數（±S）Table 1 Liver weight and liver index of mice

表1 小鼠肝臟質量和肝臟指數（±S）Table 1 Liver weight and liver index of mice

注：與Ctrl組比較，*P＜0.05差異顯著，**P＜0.01差異極顯著。

組別 肝臟質量/g 肝臟指數Ctrl組 1.173±0.090 45.02±2.21 Abx組 1.045±0.137* 41.83±2.66**PC 組 1.037±0.061** 41.59±1.43**

由表1可知，第4周小鼠的肝臟質量和肝臟指數，Abx組和PC組均顯著低于Ctrl組（P＜0.05），PC組則與Abx組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 小鼠糞便菌群及腸道病理

2.2.1 糞便細菌數量

小鼠糞便細菌數量見圖2。

圖2 小鼠糞便細菌數量Fig.2 Fecal bacteria concentration of mice

如圖2所示，第1周和第2周，Abx組、PC組小鼠糞便細菌數量均極顯著低于Ctrl組（P＜0.01），第3周Abx組小鼠糞便細菌數量顯著高于Ctrl組和PC組（P＜0.05），PC 組則極顯著低于 Ctrl組（P＜0.01），第 4周Abx組和PC組小鼠糞便細菌數量極顯著高于Ctrl組（P＜0.01）。

2.2.2 糞便菌群組成

第1周和第4周各組小鼠門水平糞便菌群組成見圖3。

圖3 第一周和第四周各組小鼠門水平糞便菌群組成Fig.3 Fecal bacteria composition of mice in the first and fourth week

如圖3所示，在門水平上，第1周Ctrl組小鼠糞便菌群組成為擬桿菌門最多，厚壁菌門次之，其余兩組均為厚壁菌門占顯著優(yōu)勢；第4周Abx組和PC組糞便菌群組成為厚壁菌門最多，擬桿菌門次之，還有部分疣微菌門，擬桿菌門所占比例較第1周明顯增加，PC組糞便菌群組成更接近Ctrl組。

2.2.3 糞便菌群α多樣性

小鼠糞便菌群的豐富度指數（Ace，Chao1）和多樣性指數（Shannon，Simpson）如圖4和圖5所示。

圖4 第1周糞便菌群α多樣性Fig.4 α diversity of fecal bacteria in the first week

圖5 第4周糞便菌群α多樣性Fig.5 α diversity of fecal bacteria in the fourth week

第1周Abx組和PC組豐富度指數與Ctrl組無顯著差異（P>0.05），多樣性指數顯著低于 Ctrl組（P＜0.05）；而PC組多樣性指數極顯著優(yōu)于Abx組（P＜0.01）。第4周Abx組多樣性指數極顯著高于Ctrl組（P＜0.01）；PC組豐富度指數顯著高于Abx組（P＜0.05），多樣性數極顯著低于Abx組（P＜0.01）。

2.2.4 腸道病理

小鼠腸道病理指標見表2，腸道病理切片見圖6。

表2 小鼠腸道病理指標（±S）Table 2 Intestinal pathological characteristics of mice

表2 小鼠腸道病理指標（±S）Table 2 Intestinal pathological characteristics of mice

結腸絨毛高度/mm 腸腺深度/mm 絨毛高度/腸腺深度 腸腺深度/mm Ctrl組 0.196±0.031 0.107±0.010 1.832±0.189 0.128±0.028 Abx組 0.181±0.036 0.094±0.013 1.968±0.458 0.118±0.021 PC 組 0.177±0.031 0.097±0.017 1.857±0.322 0.123±0.018組別 回腸images/BZ_170_1789_1658_1806_1722.png

圖6 小鼠腸道病理切片Fig.6 Intestinal pathological sections of mice

由表2可知，第4周3組小鼠回腸絨毛高度、回腸腸腺深度、回腸絨毛高度/腸腺深度、結腸腸腺深度均無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其平衡與機體健康息息相關，腸道菌群失調會影響機體生長發(fā)育，增加糖尿病、心血管疾病等慢性病的發(fā)病風險，引起胃腸道功能障礙和有毒代謝產物增多，還可通過腸道菌群-腸-腦軸引發(fā)焦慮、抑郁、認知降低等癥狀及中樞神經系統(tǒng)疾病[3-4]。

抗生素濫用已成為腸道菌群失調的重要原因，長期使用抗生素不僅會損傷腸黏膜，減弱腸道上皮屏障的防御作用，影響機體代謝，還會破壞腸道菌群平衡，增加疾病發(fā)生風險[2，12-13]。抗生素的抗菌譜、給藥途徑、腸內濃度等因素均與抗生素對腸道菌群的影響及影響時間、停止用藥后腸道菌群的恢復時間等有關[3，13]。

本研究發(fā)現，生命早期使用頭孢曲松會顯著影響小鼠體重、肝臟質量、腸道菌群數量及構成，且在停用后仍對機體有一定影響；泡菜直投菌有助于抗生素誘導的小鼠體重降低和腸道菌群失調的修復，在一定程度上修復抗生素對機體造成的損傷。

3.1 小鼠機體一般情況

第3天～第15天Abx組、PC組小鼠體重顯著低于Ctrl組，說明在生命早期使用抗生素會影響小鼠自然生長，減緩生長速度；PC組體重恢復時間早于Abx組，說明泡菜直投菌可能有助于抗生素停用后小鼠體重的恢復。萬群等[14]對新生小鼠灌胃21 d頭孢曲松后發(fā)現，生命早期使用頭孢曲松會導致小鼠體重顯著降低，且在停止干預后，到成年階段小鼠體重仍未恢復正常，這與本研究中抗生素干預的小鼠在后續(xù)喂養(yǎng)中體重恢復正常的結果不同，可能與頭孢曲松使用的生命階段、給藥持續(xù)時間、施用劑量不同等原因相關。本研究未探究頭孢曲松的劑量效應和時間梯度，頭孢曲松對小鼠自然生長的更詳細影響可進一步探索。

第4周Abx組小鼠肝臟質量和肝臟指數顯著低于Ctrl組，說明頭孢曲松會降低肝臟質量；PC組小鼠肝臟質量和肝臟指數顯著低于Ctrl組，且與Abx組無顯著差異，說明泡菜直投菌對抗生素造成的肝臟質量降低的修復不佳。抗生素造成肝臟損傷的機制可能與其誘導的腸道菌群失調有關，腸道菌群失調可使機體內毒素增高，而肝臟是機體代謝有毒物質的主要場所，內毒素不斷增高導致肝臟超過其代償能力從而造成肝臟損傷，肝臟損傷發(fā)展到一定程度時，則反過來影響腸道菌群平衡，形成惡性循環(huán)[15]。研究顯示泡菜直投菌能夠減輕大鼠肝臟脂肪變性程度，緩解小鼠急慢性酒精性肝損傷[10，16]，這與本研究結果不同，可能是肝損傷誘因、益生菌使用持續(xù)時間不同等原因所致。本研究僅測量了肝臟質量和肝臟指數，未對相關生化指標進行檢測，故頭孢曲松對肝臟是否具有損傷作用及其機制，泡菜直投菌對肝臟的保護機制仍待探索。

3.2 小鼠糞便菌群及腸道病理

第1周Abx組和PC組小鼠糞便細菌數量和多樣性指數顯著低于Ctrl組，糞便菌落組成與Ctrl組差異較大，說明頭孢曲松會破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少腸道細菌的數量。第4周Abx組和PC組小鼠糞便細菌數量顯著高于Ctrl組，PC組小鼠的糞便菌群構成和豐富度指數優(yōu)于Abx組，說明抗生素對腸道菌群的影響具有顯著的后效應，而腸道菌群穩(wěn)態(tài)在受到抗生素破壞后能夠自我修復，但無法修復到未被抗生素干擾時的狀態(tài)，Abx組糞便細菌數量增加可能是頭孢曲松殺滅腸道中大多數正常菌群，改變腸道菌群結構而導致的過度修復；泡菜直投菌可耐受消化道環(huán)境并在腸道中定植，作為腸道菌群中的有益菌，其分泌的乳酸等可改善腸道微環(huán)境，利于雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌的增殖，促進腸道菌群結構修復。

第4周3組小鼠腸道病理指標無顯著差異，可能原因如下：抗生素造成的腸道病理損傷較輕微；抗生素對腸道造成的病理損傷在后續(xù)飼養(yǎng)中逐漸恢復至基本正常。體內外研究顯示，雙歧桿菌、乳酸桿菌及其代謝產物可促進腸道上皮細胞增殖，增加腸道絨毛細胞數目，其數量與回腸黏膜厚度、絨毛高度和腸腺深度密切相關，表明益生菌在維持腸黏膜完整結構和腸黏膜屏障正常功能方面發(fā)揮重要作用，有助于減輕抗生素誘導的腸黏膜損傷并促進修復[17-18]。若要探究頭孢曲松對腸道的損傷作用，可增加1個與Abx組處理措施相同的實驗組，在第1周灌胃結束后處死采樣，觀察腸道病理。

本研究還在免疫方面做了一些探索，發(fā)現泡菜直投菌降低了脾臟IL-10的表達，但目前益生菌對于IL-10表達的作用存在爭議[19-21]，故泡菜直投菌是否具有免疫調節(jié)作用，以及其對機體產生的效應是否與免疫機制相關仍待探究。

4 結論

本研究初步探索了抗生素對小鼠腸道菌群及生長發(fā)育的影響，泡菜直投菌對抗生素誘導的小鼠腸道菌群失調的修復效果及其對機體的影響。研究發(fā)現，生命早期使用頭孢曲松可顯著影響小鼠自然生長，破壞腸道微生態(tài)平衡，且具有顯著的后效應；泡菜直投菌有助于抗生素誘導的體重降低和腸道菌群紊亂的修復。目前我國對泡菜直投菌的研究主要集中于泡菜及其發(fā)酵過程中乳酸菌菌系的分析、優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌的篩選、重要乳酸菌的生物學特性、直投式乳酸菌劑的開發(fā)等方面[22]，有關其生理作用的研究較為空缺，泡菜直投菌對腸道菌群的調節(jié)作用以及機體的改善效果仍待進一步探索。