酪蛋白酶解液組成及低豐度磷酸肽的LC-MS/MS分析

李書啟，包榮，李榮，姜子濤，*

（1.天津天獅學院食品工程學院，天津 301700；2.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

酪蛋白酶解液是營養型食品添加劑，可用于提高調味品的鮮度和游離氨基氮的含量。其所含的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）可作為功能性食品添加劑，是酪蛋白發生酶促水解后得到的一種含成簇磷酸絲氨酸基團的生物活性短肽[1-2]，它可以促進小腸對鈣的吸收[3-4]，促進骨骼對鈣的利用[5-6]，促進牙齒對鈣的利用[7-8]，促進鋅、硒、鐵的吸收與利用[9-10]，還可增強精卵的結合率[11-12]、增強動物機體免疫力[13]以及具有細胞凋亡誘導作用[14-15]。關于磷酸肽/磷酸蛋白的分析鑒定，可以提供蛋白/肽的翻譯后信息。目前最行之有效，并且被廣泛采用的是分離富集結合質譜技術[16-20]。Miquel等采用陰離子交換高效液相色譜法從嬰幼兒配方奶中富集磷酸肽，利用電噴霧液相色譜-串聯質譜技術測定了CPPs與鈣等金屬離子的結合位點[21]。黃漩等采用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜分析鑒定了駱駝乳和羊乳中的磷酸肽[22-23]。然而，和大多數蛋白一樣，酪蛋白的磷酸化豐度小，酶解產物中磷酸化肽段的含量低[24]。與此同時，磷酸化肽的離子化效率也低，在進行質譜檢測時，其信號會被高豐度的非磷酸化肽段的信號干擾和抑制[25]，甚至無法進行檢測。所以在檢測磷酸肽前，需將其從樣品中選擇性地分離富集出來[26-27]，對磷酸肽的分析更具有實際意義。

本研究采用溶膠-凝膠法合成了具有較高比表面積的多孔鈦膠微球[28-29]，并考察了所制得的鈦膠微球的選擇性以及材料的穩定性，并用于分離富集酪蛋白酶解液中的磷酸肽，利用鈦膠固定相的反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）技術，評價了多孔的鈦膠微球對CPPs的分離富集效果。進一步利用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）對酪蛋白酶解液中的肽類化合物結構進行了鑒定，對CPPs的分離富集以及結構鑒定提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、胰蛋白酶（250 U/mg）：美國Sigma公司；甲醇（色譜純）、碳酸氫銨（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；濃鹽酸（分析純）：天津化學試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津化學試劑三廠；蒸餾水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 主要儀器

G6410A型液質聯機、1200系列高效液相色譜儀：美國Agilent公司；Sachtopore-RP（250mm×4.6mm×5μm，30 nm）色譜柱：美國Zirchrom公司；JEOL場發射掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社；F-Sorb 3400全自動比表面積及孔徑測試儀：北京金埃譜科技有限公司；HSS-1B型恒溫浴槽：成都儀器廠；80-1離心機：上海手術器械廠；FA1104N電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白酶解液的制備

參照文獻的方法利用胰蛋白酶對酪蛋白進行水解[30]，制備酪蛋白的水解液。酶解結束后，沸水浴5 min殺酶，冷卻至室溫（25℃），3 000 r/min離心5 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾上清液，濾液于4℃冰箱保存備用。

1.3.2 多孔鈦膠微球的制備

參考文獻[28-29]，采用溶膠-凝膠法結合均勻沉淀法制備多孔鈦膠微球，并利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察材料表面狀態、測量其粒徑，采用氮氣吸附脫附法測定其比表面積、累積孔體積、平均孔直徑以及孔徑分布。

1.3.3 酪蛋白酶解液中磷酸肽的富集

將適量的鈦膠微球裝入玻璃層析柱（1 cm×15 cm），先用0.1 mol/L NaOH溶液（50倍柱體積）以較小流速沖洗，再用水（20倍柱體積）洗至中性。然后用0.1mol/L HCl溶液（100倍柱體積）過柱，之后再用水（100倍柱體積）洗至中性。最后用甲醇（20倍柱體積）以較小流速過柱。

在酸性、室溫（25℃）條件下保持較小流速（0.5 mL/min）進行酪蛋白酶解液上樣，接流出液，然后用水（3倍～4倍柱體積）洗去未吸附的肽類及其它成分，最后用0.3 mol/L pH10.5氨水將結合在鈦膠材料上的成分洗脫下來，接洗脫液，于4℃冰箱保存備用。

1.3.4 酪蛋白酶解液中磷酸肽的鑒定

對酪蛋白酶解液原液、流出液和洗脫液進行RPHPLC及LC-MS/MS分析。色譜條件：流動相A（20 mmol/L氟化銨）∶B（甲醇）體積比60∶40，等梯度洗脫；流速0.8 mL/min；進樣量 5 μL；檢測波長 220 nm；柱溫 45℃。質譜條件：采用電噴霧負離子源，離子源電壓3 500 V，輔助氣流速8 L/min，離子源溫度400℃。

2 結果與分析

2.1 多孔的鈦膠微球材料的表征

圖1為所合成的多孔鈦膠微球的SEM圖。

圖1 鈦膠微球材料的SEM圖Fig.1 SEM images of titania microsphere materials

由圖1可以看出，所制得的鈦膠微球材料顆粒圓潤飽滿，無塌陷碎裂現象，表面光滑平整，粒徑均勻，SEM顯示其平均粒徑為6 μm。通過氮氣吸附脫附法測得微球的比表面積為75.9 m2/g，平均孔直徑為11.9 nm，累計孔體積為0.2 mL/g。

2.2 酪蛋白酶解液中磷酸肽富集效果的RP-HPLC分析

按照方法1.3.4的色譜條件進樣分析，自制的鈦膠微球材料對酪蛋白酶解液中磷酸肽富集前后的RPHPLC分析效果見圖2。

圖2 富集前后酪蛋白酶解液的RP-HPLC圖Fig.2 RP-HPLC profiles of casein hydrolysate monitored before and after enrichment

由圖2可以看出，洗脫液在9 min后出現一個較明顯的峰，而流出液中卻沒有出現此峰，這是含磷酸基團的磷酸蛋白/肽、磷脂、天門冬氨酸等在鈦膠微球上的特異性選擇吸附所致[31]。因此，此峰可初步推斷為磷酸肽成分，在后續的LC-MS/MS分析中將確定此成分是否為磷酸肽及其是否能被自制的鈦膠微球材料富集。

2.3 酪蛋白酶解液中磷酸肽的LC-MS/MS鑒定

利用LC-MS/MS技術分別對酪蛋白酶解液原液、經鈦膠柱得到的流出液和洗脫液進行分析，所鑒定出的各物質的保留時間、碎片離子見表1。

表1 酪蛋白胰蛋白酶解液的主要成分Table 1 Components of casein hydrolysate by trypsin

由表1可以看出，酪蛋白酶解液的主要成分中1號～9號為非磷酸肽組分；10號～14號組分為氨基酸；15號和16號組分為磷酸肽組分。15號和16號組分的保留時間較其余成分有明顯增大是因為它們與鈦膠柱的作用較強，這與RP-HPLC分析的推斷結果吻合（圖2洗脫液中9 min后出現較明顯的峰）。酪蛋白水解液經鈦膠柱處理后，低豐度的磷酸肽Val-Asn-Glu-Leu-SerP*-Lys及Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP*-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys被完全吸附到了鈦膠微球表面，流出液中沒有檢測到它們的存在，說明利用鈦膠微球材料富集磷酸肽是切實可行的。因此可證明磷酸肽確實可被鈦膠微球材料富集，并且只在酪蛋白酶水解液的洗脫液中檢出了這兩種成分，而水解液和流出液中未檢出，說明已經達到預期的富集效果。另外，非磷酸肽成分Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg和天門冬氨酸在洗脫液中被檢出，這是因為Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg的末端精氨酸殘基以及天門冬氨酸也會被鈦膠特異性吸附所致[14]。

從肽鍵中間斷裂是多肽鏈3種斷裂方式中最主要的1種，斷裂之后-C端部分通常被稱為b，而-N端部分被稱為y。酪蛋白水解得到的多肽結構及其斷裂方式如圖3所示。

圖3 多肽鏈斷裂結構解析圖Fig.3 Fracture structure analysis of polypeptide chain

3 結論

酪蛋白的胰蛋白酶解液為5種游離氨基酸（Pro、His、Ala、Val、Asp）和 11 種多肽構成的混合物。其中Val-Asn-Glu-Leu-SerP*-Lys和Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP*-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys為磷酸肽。本研究所建立的方法可用于酪蛋白酶解液成分和低豐度的CPPs的分離富集及結構鑒定，提供了一種有效的方法，有望在蛋白質、磷酸蛋白、糖蛋白、磷脂、肽組學等研究領域發揮重要作用。