啤酒糟中醇溶蛋白的提取及氨基酸組成分析

閔建華，陳世乾，冉強波，石強

（湖北理工學院化學與化工學院，湖北 黃石 435000）

世界上每年啤酒的產銷量是各種酒類之首，2018年全年我國啤酒累計產量達到3 812.2萬千升，是世界主要啤酒生產國和消費國之一[1]。啤酒糟作為啤酒釀造中的主要副產物，我國每年產出含水量在80%左右的啤酒糟約為300萬噸。啤酒糟中主要成分為蛋白質、膳食纖維、糖類等，如不對其加以利用而直接丟棄，不僅會造成資源浪費，還會帶來嚴重的環境污染。

啤酒糟中蛋白質含量在15%～25%之間，主要為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白4種蛋白質[2-4]。其中醇溶蛋白占總蛋白40%～60%，不溶于水，具有較好耐熱性、成膜性、膨脹性和抗氧化性，可用于保鮮、防靜電、抗紫外線、隔氧、防潮等方面[5-9]，并且具有一定的抑菌效果。近年來，啤酒糟除了用于飼料外，還用于發酵原料和人工栽培基料提供碳源和氮源[2-3]，啤酒糟中營養物質的提取及利用也受到越來越多的關注[10-15]。通過響應面法優化醇溶蛋白的提取工藝，并對其氨基酸組成進行測定分析，為啤酒糟綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒糟：湖北理工學院化學與化工學院發酵實驗室自制；無水乙醇、茚三酮（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

DHG-Ш型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；AR2140電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2F-6000真空干燥箱：湖北科學器材公司；UV-2700紫外分光光度計：島津中國公司；TGL-16G臺式離心機：杭州匯爾儀器設備有限公司；121MB型氨基酸自動分析儀：BECAMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 啤酒糟醇溶蛋白提取

取一定量啤酒糟干粉，過40目篩，采用超聲輔助法提取啤酒糟醇溶蛋白[16-17]。

1.2.2 標準蛋白曲線的制作

參考文獻[2，6]，測定不同濃度的標準蛋白質溶液在595 nm處吸光度值，以不同濃度對應吸光度值繪制標準曲線。

1.2.3 啤酒糟醇溶蛋白提取率的計算

采用 65%的乙醇溶液，液料比為 4∶1（mL/g），經過超聲處理20 min，進行浸提，在4 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，重復上述操作3次，合并3次收集的上清液，經減壓蒸餾，冷凍干燥后得到粗醇溶蛋白粉，595 nm處測定吸光度，可得提取醇溶蛋白質量，采用下式計算提取率[9]。

1.2.4 單因素試驗

稱取5.0 g啤酒糟干粉進行試驗，分別研究不同的乙醇體積分數、超聲時間、液料比對醇溶蛋白提取率的影響。各因素水平取值分別為：乙醇體積分數55%、60%、65%、70%、75%、80%；液料比 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1（mL/g）；超聲時間 5、10、20、30、40、50 min。

1.2.5 響應面法優化試驗方案

采用響應面法對試驗數據進行處理，選用Box-Behken模型對乙醇體積分數、液料比、超聲時間等影響因素進行響應面設計，以醇溶蛋白提取率為響應值進行優化。具體因素水平見表1。

表1 醇溶蛋白提取響應面因素水平設計Table 1 Response surface factor level design of gliadin extraction

1.2.6 氨基酸含量的測定

采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中氨基酸的測定方法，對提取的醇溶蛋白采用氨基酸分析儀進行氨基酸含量的測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對大麥醇溶蛋白提取率的影響乙醇體積分數對醇溶蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數對醇溶蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of alcohol-soluble protein

大麥醇溶蛋白主要為單鏈蛋白，多由非極性氨基酸構成，無亞基結構和肽鏈間二硫鍵，肽與肽之間主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用。因含有較多疏水性殘基導致醇溶蛋白有較高的疏水性，而易溶解于非極性溶劑中[18-20]。由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，蛋白質提取率逐漸增大，在乙醇體積分數達到65%時，醇溶蛋白提取率達到最大值1.4%，因此本試驗選擇乙醇體積分數為65%作為醇溶蛋白提取適宜溶劑濃度。

2.1.2 液料比對醇溶蛋白提取率的影響

液料比對醇溶蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對醇溶蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of liquid to solid on the extraction rate of alcohol-soluble protein

由圖2可見，隨著液料比的增加，醇溶蛋白提取率逐漸增大，在液料比為 4∶1（mL/g）時，醇溶蛋白的提取率達到最大值1.37%。之后，在液料比繼續增加的情況下，醇溶蛋白的提取率不再增大，說明醇溶蛋白在液料比為4∶1（mL/g）時已被充分提取，繼續增加液料比，會造成溶劑等資源的浪費，因此本試驗選擇液料比為4∶1（mL/g）作為醇溶蛋白提取適宜液料比。

2.1.3 超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響

超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic duration on extraction rate of alcoholsoluble protein

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，醇溶蛋白提取率逐漸增大，超聲波處理可對蛋白質產生強有力的物理作用，隨著超聲波處理的進行，使得醇溶蛋白更容易分散到溶劑中被提取出來。在超聲時間為30 min時，醇溶蛋白提取率達到最大值1.38%，之后隨著時間的延長，醇溶蛋白提取率變化不大。因此本試驗選擇超聲波提取時間為30 min，作為醇溶蛋白提取適宜超聲時間。

2.2 響應面優化方案

2.2.1 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上利用Design-Expert 8.6.0軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，試驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

續表2 Box-Behnken試驗設計及結果Continue table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗

根據表2，利用Design-Expert 8.6.0軟件對試驗數據進行回歸分析，由此得到提取大麥醇溶蛋白對乙醇體積分數、液料比、超聲時間的二次多項回歸方程為：Y=1.45+0.043A-5.687×10-3B+0.028C-2.325×10-3AB+4.475×10-3AC-0.021BC-0.13A2-0.14B2-0.13C2。

對回歸模型各項方差進行分析，結果見表3。

表3 回歸模型各項方差分析Table 3 Analysis of variance of each regression model

通過表3方差分析可以看出，該模式P<0.001，表明二次回歸方程模型極顯著，模型的相關系數R2=0.999 7，校正決定系數R2Adj=0.920 9，表明模型實際值與預測值擬合良好，失擬項P=0.673 5>0.05，失擬不顯著，試驗誤差小，因此可用該模型對醇溶蛋白提取試驗進行分析與預測。

各因素對醇溶蛋白提取率的影響都極顯著，表明乙醇體積分數、液料比和超聲時間對大麥醇溶蛋白提取率影響較大；超聲時間與乙醇體積分數、超聲時間與液料比、液料比與乙醇體積分數都存在交互作用，因此表明各因素對大麥醇溶蛋白提取率的影響不是簡單的線性關系。

2.2.3 雙因素交互作用分析

液料比和乙醇體積分數的交互作用響面圖見圖4。

圖4 液料比和乙醇體積分數的互交作用Fig.4 Interaction between liquid-solid ratio and ethanol volume fraction

超聲時間和乙醇體積分數的交互作用響應面圖見圖5。

圖5 超聲時間和乙醇體積分數的交互作用Fig.5 Interaction between ultrasonic time and ethanol volume fraction

超聲時間和液料比的交互作用響應面圖見圖6。

圖6 超聲時間和液料比的交互作用Fig.6 Interaction between ultrasonic time and liquid-solid ratio

由圖4可知，當超聲時間固定在26 min時，液料比與乙醇體積分數的交互作用顯著，在所選范圍內有極值；由圖 5 可知，液料比固定為 4∶1（mL/g）時，乙醇體積分數與超聲時間交互作用明顯，醇溶蛋白提取率隨著時間的作用效果延長而增加，當超聲時間為26 min左右，乙醇體積分數為64%時，醇溶蛋白提取率最大；由圖6顯示，當乙醇體積分數為65%時，醇溶蛋白提取率受液料比和超聲時間的影響較大。醇溶蛋白提取率隨著液料比、超聲時間的增加而變大，當液料比為4∶1（mL/g），超聲時間為 26 min 左右時，醇溶蛋白提取率最大，為1.35%左右

2.2.4 優化提取工藝參數的驗證

采用Design-Expert 8.6.0軟件，分析得到的最佳工藝提取條件是：超聲時間26.66 min，液料比4.45∶1（mL/g），乙醇體積分數63.26%。在此條件下大麥醇溶蛋白提取率為1.45613%。考慮到實際操作條件，確定最佳提取條件為超聲時間27 min，液料比為4.5∶1（mL/g），乙醇體積分數為64%。經過3次平行試驗，醇溶蛋白的提取率為1.4%，與理論值相差不大。

2.3 氨基酸成分分析

啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成見表4。87.7%，必需氨基酸含量在20.52%，非必需氨基酸含量為67.18%。含量最高氨基酸為谷氨酸，含量達到40.221%，其次為脯氨酸，含量為12.991%，而作為糧食作物的第一限制性氨基酸賴氨酸含量為0.889%，含量較低。

表4 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of gliadin

啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評分見表5。

表5 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評分Table 5 Score of gliadin amino acids

由表5可知，根據世界衛生組織建議，以雞蛋蛋白質所含氨基酸比例為標準，評分為100分，對啤酒糟醇溶蛋白氨基酸進行評分，得分為46.7分，低于常見大豆蛋白氨基酸得分74分。結合表4結果，啤酒糟醇溶蛋白中必需氨基酸含量占總氨基酸含量23.4%，必需氨基酸含量占非必需氨基酸含量的30.5%，而聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織建議，理想蛋白質以上兩項占比分別要大于36%和60%[20]，說明啤酒糟醇溶蛋白氨基酸比例不理想，沒有達到理想蛋白質氨基酸比例要求，限制了啤酒糟在食品營養方面的應用。但是，啤酒糟醇溶蛋白含較多疏水性氨基酸，蛋白質之間主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用，使蛋白質分子間具有一定的水不溶性及延伸性，可通過一定技術手段制成天然高分子膜在食品保鮮等方面得到很好的應用[5，21-25]。

3 結論

在單因素分析基礎上，通過響應面法對大麥醇溶蛋白的提取工藝進行優化設計，通過Box-Behnken試驗設計建立數學模型，并進行響應面分析，得出最佳提取工藝：超聲時間 27 min，液料比 4.5∶1（mL/g），乙醇體積分數64%，此時最大醇溶蛋白提取率為1.4%。通過該法提取啤酒糟中醇溶蛋白，技術手段簡單，提取效率較高，可為啤酒糟的工業化綜合開發利用提供依據。通過對啤酒糟醇溶蛋白氨基酸含量及比例進行分析，得出啤酒糟醇溶蛋白在食品營養學方面不是一種良好蛋白質來源，但是因其特殊的氨基酸組成，使其具有柔軟、可食，黏稠及高彈性，可在食品保鮮、包裝及制藥等領域得到很好的應用。