蘆筍-平菇發酵型飲料制備工藝及其組分檢測

董玉瑋，周立輝，沙爽，張浩赟，陳學紅，曹修春

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.徐州山崎農產品技術研發有限公司，江蘇 徐州 221000）

蘆筍（Asparagus officinalis L.），屬于百合科、天門冬屬，富含有纖維素、木質素、蛋白質、礦物質等營養成分[1]，還含有多酚、皂苷、多糖等功效成分[2]，具有抗癌[3]、抗衰老、抗紫外線[4]等作用。平菇（Pleurotus ostreatus），從屬側耳科、側耳屬，氨基酸種類豐富[5]，含有人體所必需的8種氨基酸，礦物質元素含量高[6]，營養均衡[7]，其具有的多糖能調節人體免疫能力[8]，抵抗結腸癌細胞的侵襲[9]，也有利于預防腸胃、心腦血管等疾病[10]。

平菇人工栽培時間較長，限制了其營養價值的充分利用。隨著食用菌發酵技術的不斷進步，可以通過液體發酵方式獲得食用菌菌絲體和活性成分。常規液體發酵培養基多以化學試劑配制而成，加大了后續發酵液再利用、活性物質提取純化等工序的難度。一些植物例如蘆筍、牛蒡中除富含纖維素和木質素外[11]，還含有豐富的蛋白質、維生素、礦物質等營養成分[12]，因為平菇具有分解、利用纖維素和木質素的能力，因此可以利用蘆筍、牛蒡作為液體發酵的原料。因此以蘆筍為培養基液體發酵平菇，利用其發酵液進一步制備飲料，則融合了植物和食用菌的優勢，有利于發揮蘆筍和平菇的價值。目前國內外市場暢銷的飲料中，對人體健康有益的發酵飲料、食用菌飲料占比較小，且局限于直接采用子實體為原料[13]，不利于食用菌營養和功能的全面發揮。因此植物-食用菌發酵型飲料還具有很廣闊的開發和應用空間。

本文以蘆筍為主要原料，平菇為發酵菌種，采用液體深層發酵技術，制備蘆筍-平菇發酵型飲料，能很好地保持平菇的營養，同時蘆筍中的一些營養成分被降解，形成新的有效成分和風味物質，為提升蘆筍和平菇深加工產品的科技含量和市場競爭力提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料和試劑

蘆筍：徐州山崎農產品研發有限公司；平菇菌種：江蘇省高校食品資源開發與質量安全重點建設實驗室保存；檸檬酸、蔗糖、蜂蜜：蘭溪市鴻香生物科技有限公司；酵母浸膏、瓊脂、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、黃原膠、β-環狀糊精：江蘇佰耀生物科技有限公司；單糖標準品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖）、17種氨基酸標準品、乙腈（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 試驗儀器

XFS-260高壓蒸汽滅菌鍋、HC-1016離心機：浙江中友實業有限公司；THZ-98AB恒溫搖床、HH-1電熱恒溫水浴鍋、DHP-420S電熱恒溫培養箱：宜邦科析儀器有限公司；721G可見分光度計：上海譜元儀器有限公司；1 200液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；iCAPQ電感耦合等離子體質譜儀：美國Thermo公司。

1.2 培養基的配制

1.2.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基

稱取葡萄糖10 g，瓊脂5 g～10 g，土豆100 g，加入500 mL純水，pH值為自然，高壓滅菌后使用。

1.2.2 液體發酵培養基

稱取1%酵母膏和1%粉碎后的蘆筍，裝入250 mL三角瓶中，高壓滅菌后使用。

1.3 平菇菌種的活化

在無菌操作臺內將平菇菌種接入PDA斜面培養基中，28℃培養箱培養6d～8d。挑選長勢好的菌種，接種在液體發酵培養基中，28℃，120r/min搖床培養7d～9d。

1.4 穩定劑的單因素試驗

培養好的發酵菌液放入液體攪拌機，攪拌10 min，混合液4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.4.1 β-環狀糊精的添加量

向上清液中分別加入0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%的β-環狀糊精，充分溶解靜止12 h以上，計算沉淀率，每次試驗重復3次取其平均值。

1.4.2 CMC-Na的添加量

向上清液中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的CMC-Na，充分溶解靜止12 h以上，計算沉淀率，每次試驗重復3次取其平均值。

1.4.3 黃原膠的添加量

向上清液中分別加入0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%的黃原膠，充分溶解靜止12 h以上，計算沉淀率，每次試驗重復3次取其平均值。

1.4.4 沉淀率的測定

將加入不同比例的穩定劑發酵液倒入離心管，在離心機中4 000 r/min離心20 min，去上清液，將離心管與沉淀物放入電熱鼓風干燥器中烘干至恒重，稱量質量，按照公式（1）計算每組沉淀率。

1.5 調配劑的單因素試驗

以蔗糖、蜂蜜、檸檬酸3種調味劑作為3個單因素，進行感官評價，重復3次，取平均值。

1.5.1 蜂蜜的添加量

將1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的蜂蜜加入含有穩定劑的發酵液中，溶解后滅菌冷卻，品嘗并評分。

1.5.2 蔗糖的添加量

將6%、7%、8%、9%、10%的蔗糖加入含有穩定劑的發酵液中，溶解后滅菌冷卻，品嘗并評分。

1.5.3 檸檬酸的添加量

將0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%的檸檬酸加入含有穩定劑的發酵液中，溶解后滅菌冷卻，品嘗并評分。

1.6 響應面試驗設計

采用Design-Expert 8軟件，選取三因素和感官評價得分較高的3個水平，進行試驗。設計方案見表1。

表1 試驗的因素與水平Table 1 Response surface experiment

1.7 感官評價指標

感官評價表見表2。

表2 蘆筍-平菇發酵飲料感官評價表Table 2 Sensory evaluation of Asparagus officinalis L.-Pleurotus ostreatus fermented beverage

感官評價分值=25%甜度評分＋25%酸度評分＋25%香味評分+25%色澤評分。邀請15位具有一定食品感官評定基礎的食品專業人士組成評定小組[14]，依照評分指標對飲料進行感官評定。

1.8 多糖的提取和測定

1.8.1 粗多糖的提取

將發酵液4000r/min離心10min，取上清置于50℃烘箱中烘至原體積五分之一，再加入5倍體積95%乙醇，4℃冰箱中過夜醇沉后，4 000 r/min離心5 min，取沉淀于50℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.8.2 粗多糖純化

Sevag法脫蛋白：將1 g粗多糖加入10 mL純水溶解，加入2.5 mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇體積比=5∶1），將混合溶液裝入分液漏斗中振蕩18 min～20 min，取上層溶液4 000 r/min離心15 min，棄下層液體，上清液再次加入Sevag試劑，重復脫蛋白操作，至無蛋白質層，合并上清液備用。透析：取截流分子量為6 000 Da～8 000 Da的半透膜袋，沸水水浴5 min，純水將其沖開，封住一端，將上述得到的上清液倒入后封住開口的另一端，置于裝有純水的燒杯中，用磁力攪拌器進行透析，每2 h換一次水，2 d后得到烘干樣品即為精制多糖。

1.8.3 多糖測定

將1 g粗多糖加入100 mL蒸餾水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚，5 mL濃硫酸，混勻，100℃水浴15 min，冷卻至室溫（25℃），于490 nm處測定吸光度值，對照組為蒸餾水。經標準曲線計算多糖含量。

1.8.4 葡萄糖標準曲線制作

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 的葡萄糖溶液于試管中，并編號為1～9，加蒸餾水定容到2.0 mL，再在試管中加入1 mL 6%的苯酚溶液與5 mL的濃硫酸，充分混勻后放入100℃的水浴鍋中水浴15 min，冷卻后于波長490 nm處測量各個試管中溶液的吸光度值。標準曲線回歸方程為y=0.015 3x+0.014 5，R2=0.990 2。

1.9 單糖的高效液相色譜檢測

1.9.1 完全酸水解

先向多糖樣品中加入0.5 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸溶液，然后在120℃下進行100 min的水解，最后用氮吹儀將其吹干即得到單糖樣品。

標準品處理：配制10 mg/mL的單糖標準品，吸取5 mL于密封的玻璃管中，搖勻后向其中加入0.5 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸溶液，與樣品一起在120℃下進行100 min的水解，使用空氣泵吹干。

1.9.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化

向單糖樣品中加入0.5 mL濃度為0.5 mol/L的PMP試劑以及0.5 mL濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，將其搖勻后放進60℃的水浴鍋中水浴20 min，冷卻到室溫（25℃）后加入0.5 mL濃度為0.3 mol/L的HCl和0.5 mL的氯仿，充分振蕩萃取后在5 000 r/min的離心機中離心5 min，去除氯仿層后再進行兩次萃取。最后得到的水層用0.22 μm的濾膜進行過濾后使用高效液相色譜儀進行測定。

1.9.3 儀器條件

柱溫25℃，流速1.0 mL/min，波長245 nm，進樣量10 mL，流動相是0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液∶乙腈為82∶18（體積比），色譜柱是 SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.10 礦物質元素檢測

Mg、Fe、Se、Ca、Zn 等元素含量采用電感耦合等離子體-質譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[15]。取適量飲料樣品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。靜置，反應完結后，蓋蓋密封，放入微波消解儀，溫度冷卻到50℃以下，取出消解罐放入通風櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，轉移至50 mL容量瓶中，潤洗3次～4次，用超純水稀釋、定容至刻度，待測。空白對照同法處理。ICP-MS儀器參數：射頻功率為1 550 W，泵速為40 r/min，霧化室溫度為2.7℃，采樣深度5 mm，冷卻氣流速14 L/min，輔助氣流速為0.8 L/min，霧化氣流速為1.122 L/min。

1.11 高效液相色譜檢測氨基酸

適量飲料樣品中加入20 mL鹽酸，干燥，110℃水解，降溫，比色管中定容。取1 mL在85℃下吹干，加水1 mL，吹干。加入10 mL 0.02 mol/L鹽酸，振蕩。分別取500 μL，加 250 μL 0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈和250 μL 1mol/L三乙胺乙腈，衍生1 h。加2 mL正己烷，振蕩，靜置，取下層，過0.45 μm有機膜上機。SHISEIDO C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為：0.1 mol/L 無水乙酸鈉：乙腈=97：3（調 pH 6.5）；流速1.0 mL/min；柱溫 40℃；進樣量 10 μL，波長 245 nm。用外標法測定氨基酸種類，并計算質量百分比。

1.12 數據分析

采用Origin 9.0軟件處理數據并作圖，所有數據用平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 穩定劑的單因素試驗

2.1.1 黃原膠添加量的確定

在黃原膠添加量不同時，發酵液的沉淀率結果見圖1。

圖1 不同黃原膠添加量下發酵液的沉淀率Fig.1 Sedimentation rate of fermentation broth with different amounts of xanthan gum

如圖1所示，當黃原膠添加量為0.06%時有最小沉淀率0.09%。馬鵬利等[16]研究珍珠油杏杏汁發現，當黃原膠用量為0.06%時最為穩定，與本文研究結果基本一致。

2.1.2 CMC-Na添加量的確定

在CMC-Na添加量不同時，發酵液的沉淀率結果見圖2。

圖2 不同CMC-Na添加量下發酵液的沉淀率Fig.2 Sedimentation rate of fermentation broth with different addition of sodium carboxymethyl cellulose

如圖2所示，當CMC-Na添加量為0.15%時有最小沉淀率0.12%。秦丹丹等[17]黑木耳黑枸杞復合飲料發現，當CMC-Na用量為0.08%時最為穩定，與本文研究結果基本一致。

2.1.3 β-環狀糊精添加量的確定

在β-環狀糊精添加量不同時，發酵液的沉淀率結果見圖3。

圖3 不同β-環狀糊精添加量下發酵液的沉淀率Fig.3 Sedimentation rate of fermentation broth with different amounts of β-cyclodextrin

如圖3所示，當β-環狀糊精添加量為0.40%時有最小沉淀率0.11%。苗敬芝等[18]研究靈芝、金針菇混合發酵飲料發現，當β-環狀糊精用量為0.50%時最為穩定，與本文研究結果基本一致。

2.2 穩定劑復配試驗

采用上述單因素試驗最佳工藝：黃原膠的添加量為0.06%，CMC-Na添加量為0.15%，β-環狀糊精添加量為0.40%，進行穩定劑復配試驗，測得發酵液沉淀率為0.09%。

2.3 調配劑的單因素試驗

2.3.1 蜂蜜添加量

添加不同量的蜂蜜時，飲料感官鑒評的結果如圖4所示。

圖4 不同蜂蜜添加量下的飲料感官評分結果Fig.4 Sensory score of beverage with different honey content

從圖4可知，當蜂蜜添加量是2.0%時評分最高，為92分。楊晶晶等[19]研究玫瑰花、玫瑰茄復合飲料發現，當蜂蜜用量為2.1%時效果最佳，與本文研究結果基本一致。

2.3.2 蔗糖添加量

在蔗糖的添加量不同時，飲料感官鑒評的結果如圖5所示。

圖5 不同蔗糖添加量下飲料感官的評分結果Fig.5 Sensory scoring results of beverages with different amounts of sucrose

從圖5可知，當蔗糖添加量是8%時有最高評分93分。因此初步選擇7%、8%、9%作為蔗糖的添加量。張鋒等[20]研究蘋果-綠茶復合飲料發現，當蔗糖用量為8%時效果最佳，與本文研究結果基本一致。

2.3.3 檸檬酸添加量

在檸檬酸的添加量不同時，飲料感官鑒評的結果如圖6所示。

圖6 不同檸檬酸添加量下飲料感官的評分結果Fig.6 Sensory score of beverage with different amount of citric acid

從圖6可知，當檸檬酸添加量是0.30%時有最高評分91分。因此初步選擇0.25%、0.30%、0.35%作為檸檬酸的添加量。劉海燕等[21]研究人參植物飲品發現，當檸檬酸用量為0.33%時效果最佳，與本文研究結果基本一致。

2.4 響應面試驗設計結果

根據響應面軟件進行分析處理得出方案，感官評分結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計和結果Table 3 Response surface experimental design and results

續表3 響應面試驗設計和結果Continue table 3 Response surface experimental design and results

2.5 回歸模型的建立和檢驗

對表2中的數據進行分析處理，把X1蜂蜜、X2蔗糖、X3檸檬酸3個因素進行回歸擬合，可以得出相關的回歸方程，見公式（2）。

方差分析及可靠性分析見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

回歸模型P＜0.01，達到了極顯著水平；失擬項P值大于0.05，不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況；決定系數R2為0.990 5，說明實際結果與模型預測結果的一致性良好；R2adj=0.978 2，試驗結果有93.33%受試驗因素影響。該模型擬合程度好，可以用該模型對蘆筍-平菇發酵型飲料制備工藝進行分析和預測。由回歸方程和方差分析可知，模型中X1、X3、X12、X22、X32對蘆筍-平菇發酵型飲料多糖含量的影響為極顯著（P＜0.01），X2對蘆筍-平菇發酵型飲料多糖含量的影響為顯著（P＜0.05）。各因素對牛蒡茶多糖含量的影響依次為 X1＞X3＞X2，即蜂蜜＞檸檬酸＞蔗糖。

2.6 兩因素間的交互作用分析

各影響因素兩兩作用對牛蒡茶多糖含量的交互影響見圖7。

圖7 響應面分析圖和等高線圖Fig.7 Response surface analysis chart and contour map

在所選范圍內各影響因素的相互作用存在極大值，既是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。由表4數據分析可知，蔗糖與檸檬酸兩兩交互作用顯著（P<0.05），蜂蜜與蔗糖、蜂蜜與檸檬酸兩兩交互作用不顯著（P>0.05）。

2.7 調味劑最優配比和結果驗證

回歸模型確定的最佳制備工藝為蜂蜜、蔗糖、檸檬酸的最佳添加量分別為2.09%、8.11%、0.29%，此條件下對飲料最高的感官評分是94.88分。為了驗證此最佳方案，根據實際操作情況將3種調味劑的添加量分別微調為蜂蜜2.0%、蔗糖8.0%、檸檬酸0.3%，此時飲料的最高感官評分是94分，與所預期的分值接近，說明通過響應面設計方法對調配劑配方進行優化處理具有可靠性。

2.8 多糖的含量

采用上述最佳工藝條件：黃原膠0.06%、CMC-Na 0.15%、β-環狀糊精0.4%、蜂蜜2.09%、蔗糖8.11%、檸檬酸0.29%，制備蘆筍-平菇發酵型飲料，測得飲料中多糖含量是6.40 mg/mL。

2.9 飲料成分檢測

平菇多糖中單糖組分色譜圖見圖8，氨基酸組分見圖9，飲料中組分含量測定結果見圖10。

圖8 平菇多糖中單糖組分的高效液相色譜圖Fig.8 High performance liquid chromatogram of monosaccharide components in Pleurotus ostreatus polysaccharides

圖9 氨基酸組分高效液相色譜圖Fig.9 High performance liquid chromatography of amino acids

圖10 飲料成分檢測結果Fig.10 Detection results of beverage composition

從圖10可以看出，飲料多糖含葡萄糖、甘露糖等6種單糖，葡萄糖含量最高。Yang等[22]發現平菇多糖的單糖成分由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖組成，以葡萄糖為主；Daba等[23]研究平菇菌絲體中的多糖組成，發現除葡萄糖以外，還含有半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，其中葡萄糖占比最高。本研究飲料與Yang等相比，缺少鼠李糖，與Daba等相比，缺少木糖，其余組成成分則相同。

飲料中的礦物質元素主要為Ca、Mg、Zn、Se等，Mg的含量高達160 mg/kg，Se元素含量最少為0.01mg/kg。關云靜等[24]對綠蘆筍進行營養成分研究發現含有多種礦物質元素，其中K、Ca、Mg、Fe等元素含量較高，賴姍姍等[25]研究不同平菇營養成分發現Ca、Zn含量較高，與本文研究結果基本一致。

飲料中富含精氨酸、絲氨酸、甘氨酸等17種氨基酸。其中絲氨酸含量最高，為3 040 mg/kg，呈鮮味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸含量占3.48%，9種藥效氨基酸含量高達53.07%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為58.49%，接近聯合國糧食和農業組織和聯合國世界衛生組織提出的理想蛋白質（60%以上）標準，必需氨基酸與氨基酸總量比值為36.90%，和理想蛋白質（40%左右）較為接近，高于雞蛋（32.00%）、大豆（32.01%）、核桃（32.63%）和花生（34.93%），低于牛奶（40.17%），說明制備的蘆筍-平菇發酵型飲料口感鮮美，營養價值高。田穎剛[26]等研究蘆筍欠開發部位發現各部位必需氨基酸含量在27.56%至35.36%。與本文研究結果基本一致。

3 結論

通過進行穩定劑單因素試驗，3種穩定劑的最佳配方：黃原膠為0.06%，CMC-Na為0.15%，β-環狀糊精為0.4%。調味劑單因素和響應面試驗確定最佳配方：蜂蜜2.09%，蔗糖8.11%，檸檬酸0.29%，此時飲料感官鑒評評分最高，為94.88分；每兩個因素間的交互作用對飲料口感影響的大小為：蔗糖和檸檬酸＞蜂蜜和檸檬酸＞蜂蜜和蔗糖。

飲料多糖含量為6.4 mg/mL，其單糖組成為甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，葡萄糖含量最高，為282 579.42 mg/kg；飲料中含有鈣、鎂、鋅3種礦物質元素，鎂元素含量最高，為160 mg/kg。氨基酸種類齊全，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為58.49%。