真空腌制過程中魚肉水分遷移和組織結構變化規律研究

謝思蕓，李怡菲，羅丹嫻，鐘瑞敏，廖彩虎，張霞

（韶關學院英東食品學院，廣東 韶關 512005）

腌制具有延長產品保質期、賦予產品特殊風味與色澤、提高產品品質的特點[1]，是我國水產品主要的加工方式之一。目前，傳統的腌制方法主要包括干腌和濕腌。干腌方式操作方便，設備要求簡單，但產品多存在含鹽量高、魚肉質地硬和貯藏過程脂肪容易酸敗變質等問題。濕腌雖然可以提高腌魚制品的均勻性，但是腌制時間長、魚肉容易腐敗，無法保證腌魚制品的食品安全是其最大的問題[2]。新型的腌制技術如脈沖電場技術[3]、沖擊波技術[4]、超高壓腌制處理技術[5]和超聲波腌制技術[6]等與傳統的腌制方式相比較，能夠顯著提高食鹽的滲透速率，加快腌制速率，同時對于產品的色澤、保水性和嫩度等感官品質具有積極影響，但是目前多停留在實驗室階段，而且很多技術的作用機理尚不明確，是影響其工業化應用推廣的主要原因。靜態變壓腌制[7]和真空滾揉腌制技術[8]作為目前主要的腌制方式而受到關注，產品多處于真空狀態下進行腌制是其主要的特點。前期研究表明，真空腌制是目前普遍認為能夠加快腌制速度的方法，其主要原理在于真空狀態下，物料容易出現膨脹，導致細胞間距增大，結構松弛，在細胞內外壓差和毛細管共同作用下，腌制液更容易滲入組織內部，實現快速腌制[9-11]。目前的研究多集中在加快腌制速率和腌制效果對產品品質的影響，對于真空腌制過程中水分遷移與組織結構的變化研究較少。

低場核磁共振技術（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是指磁場強度在0.5 T以下的核磁共振，是可以通過測定肉品中氫原子核在磁場中的弛豫特性來確定肉品中水分的不同狀態，結合氫離子密度圖像，分析水分的分布情況，是一種無損、快速的檢測方式[12]。目前已經被廣泛應用于肉制品加工。卞瑞姣等[13]在對秋刀魚腌干過程的研究中發現，利用低場核磁共振技術，能夠與秋刀魚在腌干過程的水分狀態與變化情況建立良好的相關性，經腌制和干制處理，魚肉水分活度降低，同時改變水分存在狀態，主要表現在腌制過程中魚肉組織的部分結合水與自由水轉化為不易流動水，而經干制處理后，魚肉不易流動水出現流失與轉化現象。龍門等[14]在對咸鴨蛋腌制過程的研究中發現，低場核磁共振技術能夠很好地反映鴨蛋腌制過程中的水分分布狀態，有助于分析產品凝膠形成的原因，同時與產品的凝膠特性、質構和持水性等指標具有良好的相關性。掃描電鏡是一種利用高能聚焦電子束掃描樣品表面，從而獲得樣品信息的電子顯微鏡[15]，目前掃描電鏡已經被廣泛用于食品行業，劉歡等[16]利用掃描電鏡研究金錢腱加工后的肌纖維和結締組織的微觀結構，結果顯示在不同的加工條件下，五香金錢腱整體顯示出松散破碎的肌纖維狀態，不同程度的破碎會影響肉的嫩度。楊萬根等[17]利用掃描電鏡研究乾州板鴨加工過程中肌纖維的微觀結構變化，結果顯示板鴨的肌肉纖維在經過腌制和風干后，從原本排列緊密變得松散，纖維斷裂，且肌纖維的數量減少，肌纖維間的孔隙增大。

本文選用真空方式對草魚進行腌制，以魚肉的NaCl含量和水分含量為主要指標，結合核磁共振和電鏡等技術，探討真空腌制過程中魚肉組織水分遷移的情況以及組織結構的變化特點，為探討真空腌制機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚：市售，草魚當天宰殺，沿草魚脊骨分割成2份，在與脊骨垂直方向，將魚肉分割為長×寬×高=2 cm×2 cm×2 cm 的肉塊，每塊魚肉質量為（15±2）g，覆蓋一層保鮮膜，于4℃冰箱中冷藏備用。氯化鈉：天津市化學試劑研究所有限公司；硝酸銀：廣州市金珠江化學有限公司立新化工廠；亞鐵氰化鉀：天津市廣成化學試劑有限公司；鉻酸鉀、乙醇：天津市大茂化學試劑廠；戊二醛（25%）：天津市福晨化學試劑廠。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

MesoMR23-60H核磁共振成像分析儀：蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；TM3030臺式電子顯微鏡：日本高新技術公司；BTP-3LES冷凍干燥機：美國SPScientific公司；TE124S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；RE-5205旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DIII循環水真空泵：鞏義予華儀器有限公司；SD60制冰機：廣州市廣紳電器制造有限公司；TESTO-176T4溫度記錄儀：德圖儀器國際貿易（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

利用4℃、6%的低溫鹽水作為腌制介質，在不同腌制時間（40、80、120、160、200、240、280 min）下，選用真空腌制方式（真空度0.08 MPa）對魚肉進行處理。提前將2 L、4℃、6%的鹽水與魚肉一同放入真空瓶中，并浸沒在含8 L、4℃載冷劑（乙醇∶乙二醇∶水=3∶3∶4，體積比）作為冷卻液的循環裝置中，調整真空瓶高度，保證真空瓶內外液面齊平，安裝相應的溫度探頭并啟動真空裝置進行腌制；在試驗過程中，為了保證溫度的穩定性，利用低溫恒溫槽對載冷劑進行恒溫，保證冷卻液溫度控制在（4±2）℃；為了減少溫度帶來的影響，魚肉和鹽水均提前冷卻至4℃。每組試驗樣品共12塊魚肉，取樣測定NaCl含量和水分含量，并進行核磁與掃描電鏡檢測，每組試驗平行3次，數據結果用平均值±方差表示。

1.4 指標測定

1.4.1 NaCl含量的測定

NaCl含量測定參考國標GB 5009.44—2016《食品安全國家標準食品中氯化物的測定》[18]的銀量法。計算方法見式（1）。

式中：X1為食品中氯化鈉的含量，%；0.035 5為1.00 mL硝酸銀標準滴定溶液（濃度1.000 mol/L）的換算系數；c1為硝酸銀標準滴定溶液的濃度，mol/L；V1為用于滴定的試樣體積，mL；V2為滴定試樣時消耗的硝酸銀標準滴定溶液體積，mL；V0為空白試驗消耗的硝酸銀標準滴定溶液體積，mL；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質量，g。

1.4.2 水分的測定

水分的測定參考國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[19]的直接干燥法。試樣中的水分含量按式（2）進行計算。

式中：X2為試樣中水分的含量，%；m1為稱量瓶和試樣干燥前的質量，g；m2為稱量瓶和試樣干燥后的質量，g；m3為稱量瓶的質量，g；100為單位換算系數。

1.4.3 核磁共振測定方法

將完成腌制的魚肉，置于低場核磁共振設備中用于測量自旋-自旋弛豫時間。該儀器配備0.5 T永磁體，對應的質子共振頻率為21.718 MHz，測試溫度為32℃，測試方法參考GENG等[20]的方法。將樣品放入核磁共振60 mm的石英管中，應用60 mm直徑的射頻線圈（90 °和 180 °脈沖時間分別是 5.4、11.6 μs，回聲時間為 0.2 ms），收集自旋回訊磁振脈沖（carr-purcell-meiboom-gill，CPMG）衰減信號。CPMG參數設置如下：等待時間4 500 ms，模擬獲得20 db，信號增幅3，回波數量18 000，掃描頻率4，前置放大增幅1。通過4次掃描重復獲得8 000個回波數據。兩次掃描之間的充盈時間為4 s，每次測量重復3次[21]。使用MultiExp Inv分析軟件進行CPMG衰減曲線的分布式多指數擬合（1 000 000次）。使用SRIT軟件對弛豫數據進行多指數擬合分析獲得改進的擬合。從峰位置計算每個過程的峰頂時間，并通過積累積分確定每個相應弛豫時間的弛豫峰面積[21]。

質子密度圖像通過自旋回波（spin echo，SE）成像序列獲取。掃描參數如下：視角為100 mm×100 mm；切片厚度2.5 mm，切片間距1 mm，重復采樣等待時間1 500 ms，回波時間20 ms，累加次數16，讀取大小256，相位大小192。采用NIUMAG核磁共振影像系統Ver 1.0軟件對樣品的質子密度圖像進行處理[20]。

1.4.4 掃描電鏡測定方法

參考康大成[22]的方法，并稍作修改，取魚肉中心位置，沿脊背垂直方向切出厚度約為1 mm、寬度為1 cm的樣品，先將樣品浸沒在4℃、2.5%戊二醛中固定2 h，經50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度脫水（15 min/次），再將樣品放置在100%乙醇溶液中脫水3次（30min/次），然后，將上述樣品放置在100%叔丁醇中置換3次（3 min/次），最后，將樣品放入-80℃預凍24 h，冷凍干燥5 h，置于干燥皿中，進行電鏡掃描。

1.5 數據處理

測定和分析結果分別采用Origin9.0、GraphPad Prism 6.0、NIUMAG核磁共振影像系統Ver 1.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 魚肉真空腌制過程中NaCl和水分含量的變化趨勢

腌制時間對魚肉NaCl和水分含量的影響見圖1。

圖1 魚肉真空腌制過程中腌制時間對NaCl和水分含量的影響Fig.1 Influence of salting time on NaCl and water content during vacuum salting of fish

由圖1可知，在真空腌制過程中，魚肉NaCl含量隨著腌制時間延長呈現持續上升最后下降的趨勢。在0～40 min，NaCl含量上升速度較快，在40 min時達0.77%，隨后NaCl含量持續上升，并在240 min時達到最大值，為1.48%。而魚肉的水分含量隨腌制時間延長則呈現持續下降的趨勢，由最初的78.0%下降至75.5%，其原因是真空腌制過程，魚肉組織中的空氣和水分被不斷地排出，組織發生膨脹，導致細胞間距增大，有利于鹽分的滲透，而NaCl含量增大，又進一步促進水分排出組織，這與高凱日等[23]的研究結果一致。

2.2 魚肉真空腌制過程中弛豫時間的變化趨勢

腌制時間對魚肉弛豫時間的影響見圖2。

圖2 魚肉真空腌制過程中腌制時間對弛豫時間的影響Fig.2 Influence of salting time on relaxation time during vacuum salting of fish

由圖2可知，隨著腌制時間的延長，不同狀態的水分弛豫時間均發生變化，說明在腌制過程中，鹽含量增加會明顯改變樣品中水的存在形式。隨著腌制時間延長（0～120 min），強結合水弛豫時間（T21）變化不明顯，弱結合水弛豫時間（T22）呈先上升后下降最后保持平緩的趨勢，且在120 min達到最大值。束縛水弛豫時間（T23）的變化與T22的變化一致，也是呈現先上升后下降，最后保持平緩的趨勢，同樣在120 min處達到最大值。自由水弛豫時間（T24）的變化則是先平緩上升，再突然出現陡升（120 min～160 min），最后又基本穩定（160 min～280 min）。其原因可能是在 0～120 min的腌制時間內，魚肉組織中逐漸滲入帶電的金屬離子，與帶相反電荷的蛋白質基團相互作用，從而形成一個電子雙電層，削弱了蛋白質間的分子斥力[24]，能夠降低蛋白質的表面疏水性，蛋白質開始出現聚集，從而導致了自由水、束縛水和結合水的自由度增加，這與孔保華等[25]的研究結論相一致；而120 min后出現拐點可能與魚肉腌制過程中魚肉中蛋白質的進一步聚集、交聯，最后形成溶膠有關，溶膠的形成反而會導致自由水的自由度增加，而束縛水和結合水的自由度下降，這與裴志勝等[26]和林婉瑜等[27]研究結論相一致。

2.3 魚肉真空腌制過程中弛豫峰面積比例的變化趨勢

腌制時間對弛豫峰面積比例的影響見圖3。

圖3 魚肉真空腌制過程中腌制時間對弛豫峰面積比例的影響Fig.3 Influence of salting time on relaxation peak area ratio during vacuum salting of fish

由圖3可知，隨著腌制時間的延長，魚肉的弛豫峰面積比例（P21、P22、P23、P24）均發生變化。對于結合水弛豫峰面積比例（P21、P22）而言，隨著腌制時間的延長，均出現整體上先上升后下降再上升的變化，這說明在腌制過程中存在部分結合水與其它水分相互轉變的情況。而對于束縛水弛豫峰面積比例（P23）而言，隨著腌制時間延長出現上下波動的變化趨勢，在120 min時P23最大，說明此時有大量其它的水分形式轉變為束縛水，隨后P23逐漸減小，說明此時束縛水又轉變為其它水分存在形式。對于自由水弛豫峰面積比例（P24）而言，隨著腌制時間延長，出現先上升后下降，而后再上升的變化。值得注意的是，P24出現銳減變化的時間點（120 min）正是P23出現劇增變化及P22出現銳減變化的時間點，其原因可能是此時的鹽溶性蛋白質進一步溶出并與水發生水化作用，形成溶膠狀態，使得其中一部分水分被束縛在溶膠中，而另一部分水分則被排擠出溶膠組織外，這與上述3種水分的弛豫時間變化所表現的水分自由度變化相一致。

2.4 魚肉真空腌制過程中核磁成像（magnetic resonance imaging，MRI）的變化

魚肉真空腌制過程中MRI的變化趨勢見圖4。

圖4 魚肉真空腌制過程MRI的變化圖Fig.4 Changes of MRI during fish vacuum salting

MRI是核磁共振技術的主要成像工具，不僅可以確定食品樣品中水分的分布，還可以顯示魚肉真空腌制在不同腌制時間組織內部結構的變化[20]。水的分布可以用偽彩色圖像來表示，其中紅色表示高的質子密度，即具備更好自由度；藍色代表低質子密度，即具備低自由度[28-29]。從圖4中可以看出，隨著腌制時間延長，質子密度圖像MRI顏色由藍色向黃色轉變，說明魚肉組織的自由度持續上升，而且黃色區域在120 min開始明顯增大，達到160 min后，黃色區域呈現最大化，并基本維持不變，可能是因為在120 min開始，蛋白質發生疏水性聚集，形成溶膠，此時結合水自由度達到最大，大量結合水轉變為束縛水，與弛豫時間、弛豫峰面積比例變化的結論一致。

2.5 魚肉真空腌制過程中微觀結構的變化

圖5是魚肉樣品經戊二醛固定凍干后的掃描電鏡圖。

圖5 魚肉真空腌制過程中微觀結構的變化圖Fig.5 Changes in the microstructure of fish during vacuum salting

由圖5可知，初始的魚肉樣品的肌纖維結構呈明顯的絲狀，而且纖維組織間結構緊致，40 min的魚肉樣品與初始的樣品結構相似，纖維組織清晰且結構緊致，其原因可能是此時魚肉腌制時間較短，鹽分較少進入組織，因此能較好地保留肌纖維絲狀結構。當腌制時間達到80 min時，樣品肌纖維開始出現膨脹，纖維組織結構被打開，肌纖維的絲狀結構相對清晰，120 min的樣品與80 min的較相似，但膨脹程度和結構松散程度較80 min明顯，肌纖維絲狀結構開始模糊，其原因可能是，在真空腌制過程，鹽分大量進入組織中，降低蛋白質的疏水性，顯著提高蛋白質的溶解性，水化能力增強，當腌制時間達到160 min時，樣品的肌纖維已經充分膨脹，纖維結構開始呈片狀出現，而且隨著腌制時間延長（160 min～280 min），肌纖維結構完全呈片狀出現，與姜晶丹等[30]的研究結果一致，其原因可能是，隨著鹽分含量持續增加，加劇蛋白質間的交聯，水化能力增強，導致纖維細胞內粗絲和細絲膨脹，細胞的間隔變小從而連接形成片狀，此結論與弛豫時間、核磁成像等結論一致。

3 結論

本文對魚肉真空腌制過程中的水分遷移與組織結構變化進行研究。結果表明：隨著腌制時間延長，魚肉組織的NaCl含量持續上升，而水分含量持續下降，而隨著鹽分的不斷滲入，魚肉組織蛋白質因疏水性持續下降而逐漸聚集并形成溶膠，導致水分的自由度發生變化，并出現明顯的水分遷移現象，魚肉組織的肌纖維由最初清晰、緊致的絲狀結構逐漸發生膨脹、松散最終變成片狀。綜上所述，魚肉在真空腌制過程中的水分遷移和組織結構變化與魚肉腌制過程中的凝膠化呈現很好的相關性。該結論為真空腌制技術在魚肉腌制的應用上提供了相關理論基礎。采用透射電鏡技術與電泳技術探討腌制過程組織肌纖維的Z帶的變化以及蛋白質組成的變化仍然是下一步研究的重點。