莠去津?qū)茸愚r(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

黃瀟 蔡穎慧 趙小珍

摘要：以山西省太原市陽曲縣谷子種植區(qū)土壤為研究對象，運用IlluminaHiSeq高通量測序技術(shù)，分析莠去津脅迫下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化。由α多樣性指數(shù)分析可知，莠去津降低了土壤微生物的豐富度和群落多樣性，噴灑濃度越高，豐度和多樣性越低;在黃土高原谷子種植區(qū)，土壤真菌主要門類為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）;土壤細(xì)菌主要門類為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門 （Gemmatimonadetes） 、擬桿菌門（Bacteroidetes）。從門、綱水平上進(jìn)行分析，高濃度莠去津污染土壤樣品和低濃度莠去津污染土壤樣品中的優(yōu)勢真菌和細(xì)菌種類基本相同。

關(guān)鍵詞：莠去津;谷子農(nóng)田;土壤微生物;高通量測序;真菌;細(xì)菌

中圖分類號： X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0210-04

莠去津別稱阿特拉津，是一種內(nèi)吸選擇性除草劑，可以有效防除多種一年生禾本科和闊葉雜草，殺草譜廣，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于谷類作物生產(chǎn)中。但殘留于土壤中的莠去津會影響后茬作物生長，污染農(nóng)田土壤，造成地下水污染，導(dǎo)致土地“癌化”，還會給土壤微生物帶來不可估量的破壞。土壤微生物參與土壤碳、氮等元素的循環(huán)，發(fā)揮著有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、有害物質(zhì)降解等重要作用，可通過硝化、固氮、土壤酶釋放、生物降解等生化過程來改善土壤生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物是影響土壤質(zhì)量的重要因素之一。研究除草劑施用后土壤中微生物的群落組成結(jié)構(gòu)，對于改善土壤結(jié)構(gòu)具有重要的理論指導(dǎo)意義[1-4]。

本研究對山西省谷子主產(chǎn)區(qū)之一——陽曲縣的土壤樣品進(jìn)行土壤理化性質(zhì)分析，并通過IlluminaHiSeq高通量測序，分析其微生物群落組成及多樣性，比較不同程度莠去津干預(yù)下土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)差異，對于了解莠去津?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊懠巴寥牢⑸锘謴?fù)，為建立谷子產(chǎn)區(qū)莠去津污染檢測的生物指標(biāo)奠定理論及試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地點位于山西省太原市陽曲縣定點試驗田（112°32′15.35″E、38°05′18.06″N）。試驗地地勢平坦，境內(nèi)屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫 6～9 ℃，年平均降水量為441.2 mm，無霜期為 164 d 左右。試驗區(qū)的土壤類型為山西黃土，供試作物為谷子。

1.2 試驗設(shè)計與取樣

1.2.1 試驗設(shè)計 采用38%莠去津水懸浮劑，試驗時間為2017年6月上旬至7月上旬，對谷子幼苗3～4葉期進(jìn)行噴霧處理。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道的莠去津的處理劑量和正常使用情況下土壤中莠去津的濃度[5-6]，藥劑用量設(shè)計為4個處理，即：0、2、5、8 L/hm2。

1.2.2 土壤取樣 2019年9月份，采用五點法取樣采集2～20 cm表層土樣。過2 mm篩子，去除雜草、碎石等雜質(zhì)，4 ℃保存待用。部分土樣自然風(fēng)干，用于土壤基本理化性質(zhì)測定。測定方法參照國際中的測定方法，每個樣品做3個平行測定[7]。供試土壤樣品的理化性質(zhì)見表1。

1.2.3 土壤樣品PCR 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行土壤樣品DNA的提取。稱取0.5 g保存于 4 ℃ 冰箱中的土壤樣品，按試劑盒說明書過程提取土壤樣品總DNA;將提取得到的DNA溶解于50～100 μL TE Buffer中，20 ℃保存。

細(xì)菌擴(kuò)增：選擇16S rDNA V4區(qū)域擴(kuò)增通用引物，以5～50 ng DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增細(xì)菌DNA片斷[8];真菌擴(kuò)增：選擇ITS2 可變區(qū)擴(kuò)增通用引物，以5～50 ng DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增真菌 ITS rDNA[9]。

1.2.4 高通量測序 采用2%濃度的瓊脂糖凝膠對土壤樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，利用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。構(gòu)建真菌ITS rDNA、細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)域文庫，Qubit 和實時定量 PCR檢測合格后，通過Illumina MiSeq上機(jī)測序[9-10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對測得的土壤樣品的所有序列進(jìn)行聚類、分析，按照97%的相似度將獲得序列聚類成同一分類操作單元OTUs，通常每一個 OTU被視為一個微生物物種。將OTUs與ITS rDNA、16S rDNA片斷進(jìn)行比對，并對OTUs 的代表序列進(jìn)行物種注釋分析，確定擴(kuò)增序列對應(yīng)的微生物，并分析不同物種分類水平下各樣本的群落組成。根據(jù) OTU 分析結(jié)果，對樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，采用Qiime 1.9.1計算土壤微生物α多樣性指數(shù)[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度莠去津下土壤微生物群落組成

土壤微生物高通量測序結(jié)果（表2）顯示，從4個土壤樣品中共檢測到325 182個真菌原始序列數(shù)，屬于子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）5個菌門;共檢測到441 513個細(xì)菌原始序列數(shù)，屬于變形菌門（Proteobacteria） 、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes） 、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi） 、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）這9個菌門。依據(jù)97%的相似度劃分為真菌OUTs數(shù)為393～489，細(xì)菌OUTs數(shù)為593～705。

2.2 不同莠去津干擾下土壤微生物多樣性分析

多樣性指數(shù)是用來測定物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，主要有3個空間尺度：Alpha（α）多樣性、β多樣性、γ多樣性。其中α多樣性，重點關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目，通過單樣本的多樣性分析反映樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。通常有測序深度指數(shù)（Observed spieces 和Goods coverage）、菌群豐度（Chao1和ACE）和菌群多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）。Goods-coverage指數(shù)數(shù)值越高，表示樣品被測出的概率越高;Chao1或ACE指數(shù)越大，表示群落豐富度越高;Shannon指數(shù)越大，表示群落多樣性越高[13-14]。

由表3可知，對照土壤中真菌與細(xì)菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均為最高，說明沒有噴灑莠去津的土壤樣品中，物種豐度最高;對照土壤中Shannon指數(shù)最高，說明土壤群落多樣性最高;而在莠去津噴灑濃度為8 L/hm2情況下，ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均為最低，說明在此噴灑濃度下，土壤微生物群落豐富度和多樣性均最低。

2.3 不同濃度莠去津下土壤微生物群落組成

不同濃度莠去津脅迫條件下，土壤微生物優(yōu)勢物種的相對豐度如圖1、圖2所示。土壤真菌主要門類為子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門、球囊菌門，在4個土壤樣品中這5個門的相對豐度可分別占平均值的61.9%、12.5%、6.8%、1.9%和0.9%，另外，未明確分類真菌（Unidentified）也占有較高比例（16.2%）。土壤中細(xì)菌優(yōu)勢菌群為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，分別平均占比30.38%、15.76%、12.69%、8.29%、6.12%，其相對豐度之和可以占到73.24%，相對豐度超過2%的還有厚壁菌門 （3.92%）、綠彎菌門（3.59%）、浮霉菌門（2.17%）、疣微菌門（2.0%）。

由圖1、圖2可以看出，噴灑不同濃度莠去津土壤中微生物優(yōu)勢門類相對豐度有一定的差異。真菌類群中，接合菌門在4種土壤樣品中的相對豐度變化不大;擔(dān)子菌門和球囊菌門的相對豐度在對照土壤中高于其他3種噴灑過莠去津的土壤。對照土壤以及噴灑濃度為2 L/hm2的土壤中子囊菌門相對豐度大于莠去津噴灑濃度為5、8 L/hm2的土壤;在細(xì)菌類群中，變形菌門在4種土壤樣品中的相對豐度變化不大;其他門類細(xì)菌在對照土壤中相對豐度均大于噴灑莠去津的土壤。未噴灑過莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。

進(jìn)一步考察樣品中土壤微生物在綱水平下的優(yōu)勢相對豐度。如圖3所示，4種土壤樣品中真菌綱水平的優(yōu)勢物種主要有傘菌綱（Agaricomycetes，23.03%） 、糞殼菌綱（Sordariomycetes，16.38%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes，2.59%）、座囊菌綱（Dothideomycetes，4.69%）、未明確分類真菌（Unidentified，15.56%）、錘舌菌綱（Leotiomycetes，3.97%） 、絲孢綱（ Hyphomycetes，1.64%）、球囊菌綱 （Glomeromycetes，0.32%）、其他 （Others，31.82%）。

如圖4所示，4種土壤樣品中細(xì)菌的優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria，12.29%）、α-變形菌綱（α-Proteobacteria，10.87%）、β-變形菌綱（β-Proteobacteria，9.67%）、酸桿菌綱（Acidobacteria，11.34%）、放線桿菌綱（Actinobacteria，10.69%）、芽單胞桿菌綱（Gemmatimonadetes，7.45%）、酸微菌綱（Acidimicrobiia，5.71%）、硝化螺菌綱（Nitrospira，2.58%）、浮霉菌綱（Planctomycetacia，2.03%）。同時，γ-變形菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱為優(yōu)勢菌綱，其相對豐度之和可以占到總數(shù)的54.86%。

土壤樣品中，傘菌綱的相對豐度最高，可占到所有真菌綱的18.6%～27.7%，糞殼菌綱的相對豐度可以占到所有真菌綱的14.7%～19.1%。細(xì)菌中，變形菌綱的相對豐度最高，可占到所有細(xì)菌綱的30%以上。對照土壤和莠去津濃度為2 L/hm2的土壤樣品中，優(yōu)勢菌綱的相對豐度變化不大，但均大于5、8 L/hm2的土壤中優(yōu)勢菌綱的相對豐度。未噴灑莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。

3 結(jié)論與討論

土壤微生物參與土壤碳、氮等元素的循環(huán)及養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化過程，可以調(diào)控土壤碳截獲能力和有機(jī)碳礦化過程，影響生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力，在一定程度上可以直接反映土壤肥力的高低[15]，同時土壤微生物比較敏感，易受到外界環(huán)境條件的影響。土壤類型、含水量、有機(jī)碳和總氮含量等理化性質(zhì)以及作物種類、種植制度、土壤類型、水肥管理等農(nóng)業(yè)管理措施都會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[16-18]。在本研究中，以山西省黃土高原谷子種植區(qū)土壤為研究對象，考察不同濃度莠去津干預(yù)下土壤真菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化情況。由于受其他人為干擾因素較少，4種類型的土壤樣品理化性質(zhì)差異不顯著，莠去津為影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

研究結(jié)果表明，未噴灑過莠去津的對照土壤中微生物多樣性更為豐富。從門、綱水平上對黃土高原谷子種植區(qū)土壤真菌和細(xì)菌群落進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同濃度莠去津脅迫下土壤樣品中的優(yōu)勢真菌種類基本相同，但優(yōu)勢真菌的相對豐度不同。谷子種植區(qū)土壤真菌的優(yōu)勢門類為子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門、球囊菌門，優(yōu)勢綱類為傘菌綱、糞殼菌綱;細(xì)菌的優(yōu)勢門類為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，優(yōu)勢綱類為 γ-變形菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、酸桿菌綱、放線菌綱，這與絕大多數(shù)土壤細(xì)菌的優(yōu)勢細(xì)菌種類基本相同[18-19]。

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