雞腸源益生口乳桿菌的分離鑒定與生物學特性

顏世卿 馬軻 陳巍

摘要：從雞腸中分離得到嚴格厭氧共生菌，篩選出適合禽類生產的益生菌株，探討其益生性，為其應用奠定基礎。通過采集雞腸黏膜，特定厭氧培養基分離純化腸道厭氧共生菌。根據抑菌活性篩選得到口乳桿菌，隨后，對其進行生物學基本特性分析，包括生長曲線、酸耐受、膽鹽耐受、溶血性、細胞毒性分析等。結果顯示，口乳桿菌的對數生長期為24～60 h;對酸和膽鹽有優良的耐受力;不具有多重耐藥性;不具有溶血活性;對小鼠腹腔巨噬細胞細胞系Raw264.7沒有細胞毒性;為后續微生態制劑以及抑菌物質研究提供了理論依據。

關鍵詞：雞腸道;口乳桿菌;分離鑒定;益生性

中圖分類號：S852.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0157-05

動物的腸道中存在著大量而多樣的微生物群體，我們將其稱為腸道菌群。在這些菌種中，包含大量乳酸菌（LAB），其中乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌為腸道中的優勢菌群。目前所分離得到的乳桿菌種大多來自人和動物的胃腸道，其次是蔬菜及發酵產品[1]。乳酸菌是最重要的微生物之一，可用于食品發酵以及增強發酵食品的口感和質感[2-3]。它們的主要特征是由葡萄糖作為原料生產乳酸、抑制細菌腐敗食品和病原體繁殖的生長抑制物質（如細菌素、過氧化氫、二酰基等）[4]。

在某些生產供人類食用的動物的生產系統中，禁止使用許多抗生素，因此在這些系統中，益生菌的使用是重要的工具，不僅可以改善動物健康狀況，減少疾病的發生率，而且可以提高生產率和食品質量。LAB是動物腸道菌群的一部分，對健康具有重要作用。實際上，已證明對動物使用LAB可以改善健康狀況，提高疾病抵抗力并增強生長和生殖性能[5]。

LAB在動物生產中的用途已得到廣泛研究。在家禽生產中，乳酸菌素對生長性能、禽體性狀、腸道菌群、血清生化成分、免疫參數和盲腸菌群以及明顯的回腸營養消化率具有積極作用。由于某些LAB對病原菌具有抗菌作用，因此它們可以增加禽類對感染的抵抗力，防止不良影響并改善宿主健康。例如：已證明從雞的直腸樣本中提取的片球菌屬（Pediococcus sp.）對腸炎沙門氏菌和大腸桿菌具有抗菌活性[6]。

本試驗從健康雞腸道中通過嚴格厭氧培養分離口乳桿菌菌株，并評價其益生特性，以期為研發雞用微生態制劑、實現健康養殖奠定理論基礎。

1 材料與方法

試驗在吉林大學動物醫學學院微生物與免疫實驗室內進行，試驗時間為2019年9月至2021年4月。

1.1 試驗動物、菌株與細胞

三黃雞購自長春市農業科學院，正常飼喂12～16周后用于試驗。

本試驗所使用的鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（ Escherichia coli）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）以及小鼠腹腔巨噬細胞系Raw264.7等菌株和細胞由實驗室保藏。

1.2 主要試劑

瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白、葡萄糖，均購自OXOID公司;腦心浸出液肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、MRS肉湯，均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司;胎牛血清、綿羊血，均購自Gibco公司（美國）;細菌分離培養用維生素、微量鹽，均購自原葉生物有限公司;牛膽鹽、濃鹽酸溶液，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 雞腸共生菌分離培養基（YCFA）配制

BHI培養基18.5 g、酵母提取物5 g、TSB培養基15 g、葡萄糖0.5 g、磷酸氫二鉀2.5 g、氯化鈀0.33 g、黏蛋白4 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養基添加1.5%瓊脂，115 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至45 ℃繼續加入5%（體積分數）胎牛血清、維生素K3 5 μg、氯化血紅素10 μg、微量鹽1 mL、D-生物素10 μg、維生素B12 10 μg、吡多胺（維生素B6）100 μg、葉酸（維生素B9）50 μg、L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物0.6 g即得。

1.4 雞腸源共生菌分離培養

提前準備YCFA瓊脂和液體培養基，置于厭氧培養箱中平衡24 h;將適齡三黃雞采用急性失血法處死后，剖開腹腔，暴露腸道，用止血鉗夾住所需盲腸兩端，用手術剪沿止血鉗外端剪開，拿出腸段;超凈臺中，用手術剪剪開盲腸，暴露腸內容物，用手術刀輕柔刮去腸內容物，換刀繼續刮取腸黏膜，PBS倍比稀釋后，平板劃線于YCFA瓊脂平板;37 ℃厭氧培養48 h，挑取單菌落至YCFA培養基中繼續培養，重復平板劃線，直至整個平板菌落單一。

1.5 分離菌株的鑒定

選取菌落單一的菌株，培養至對數生長期，將菌液送往吉林省庫美生物科技有限公司進行16S rRNA測序，所得序列通過NCBI BLAST，同GenBank數據庫中已知菌株序列進行比對，確定菌株種屬。

1.6 抑菌活性菌株的檢測

將培養48 h的共生菌擴增菌液8 000 r/min，4 ℃ 離心10 min，上清用0.22 μm濾膜過濾得到無細胞發酵液，將培養好的指示菌鼠傷寒沙門菌按1%（體積分數）接種至相應40 ℃高壓滅菌后的瓊脂培養基中，輕柔并迅速混合均勻后倒板，待瓊脂培養基凝固后，在表面放置牛津杯，每個牛津杯內加入 200 μL 上述無細胞發酵液，在生物潔凈工作臺中擴散3 h后，37 ℃培養9 h，檢測是否有抑菌圈出現，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.7 口乳桿菌抑菌活性檢測

采用牛津杯瓊脂擴散法檢測口乳桿菌Y62的抑菌活性。首先將10 mL 2%瓊脂傾倒在滅菌平板上，待其凝固后，加入含有100 μL指示菌懸液的相應指示菌瓊脂培養基10 mL，待凝固后，以無菌操作在培養基表面垂直加入牛津杯，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，在杯中加入Y62的CFS 200 μL，每組重復3次，37 ℃培養12～18 h。測定抑菌圈直徑。

1.8 口乳桿菌的生長曲線測定

提前準備MRS培養基和平板，置于厭氧培養箱中平衡24 h，并測定MRS培養基pH值;挑取MRS瓊脂上的口乳桿菌Y62單菌落于MRS培養基中，37 ℃ 厭氧培養48 h;調節菌液濃度至對數生長期（D600 nm為0.8～1.2）;將菌液按1%（體積分數）接種量接種至預平衡的MRS培養基中，37 ℃厭氧培養;每 12 h 吸取1 mL菌液，檢測其D600 nm并涂布平板;根據D600 nm值和平板菌落計數繪制生長曲線。

1.9 口乳桿菌的酸耐受、膽鹽耐受檢測

用1 mol/L鹽酸將MRS液體培養基的pH值分別調節至2、3、4、5、6;另向MRS液體培養基中加入0.1%、0.2%和0.3%的牛膽鹽;將Y62菌株活化2代后，以1%（體積分數）接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養至對數生長期;離心收集細菌;將Y62調整至所需濃度，將菌體重新懸浮于不同pH值以及含牛膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養3 h;采用平板涂布法計算在不同條件MRS培養基中培養0 h和3 h的活菌數量，試驗重復3次;存活率計算：存活率=N1/N0×100%，式中：N1表示3 h測定的活菌數，lg CFU/mL;N0表示0 h測定的活菌數，lg CFU/mL[7]。

1.10 口乳桿菌的藥物敏感性檢測

提前準備MRS培養基和平板，置于厭氧培養箱中平衡24 h;取保藏的Y62菌株，活化2代后接種至MRS培養基中，37 ℃厭氧培養至對數生長期;離心收集細菌;將Y62調整至0.5麥氏單位濃度，50 μL 涂布平板;夾取藥敏紙片平放在含菌平板上，每個平板放置6種藥敏片;37 ℃厭氧培養16～24 h;質控菌株為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300_TCH1516;觀察并測量Y62抑菌圈直徑，并參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute）推薦的紙片擴散法標準進行判定。

1.11 口乳桿菌的溶血性檢測

配制100 mL BHI瓊脂，加入7 mL新鮮滅菌綿羊血，倒板，4 ℃保存備用;向血平板上滴加10 μL濃度為108 CFU/mL的口乳桿菌Y62，對照組滴加10 μL相同濃度的金黃色葡萄球菌;37 ℃厭氧培養48 h;觀察血平板，接種物周圍的半透明光環表明存在溶血活性。

1.12 口乳桿菌的細胞毒性檢測

取保存的Raw264.7細胞傳代3次后消化，按 1×105 cell/well接種至96孔細胞培養板，正常培養12 h;輕柔吸棄細胞培養基，PBS清洗2次后，加入不含雙抗的DMEM 90 μL，再加入調整好濃度的Y62菌液10 μL，對照組加入10 μL MRS液體培養基;4 ℃、1 000 r/min水平離心2 min，37 ℃ CO2培養箱培養;6、24 h對細胞通過CCK-8試劑盒檢測存活率。

1.13 數據分析

應用GraphPad Prism 6.0分析軟件，并采用Multiple t test對研究數據進行分析統計。

2 結果與分析

2.1 分離培養結果

本試驗共分離培養共生菌菌株41株，分屬于乳桿菌屬、腸球菌屬、螺桿菌屬、普雷沃菌屬、芽孢桿菌屬等5個屬11個種，具體種類見表1。

2.2 抑菌活性檢測結果

分離菌株的抑菌活性檢測如圖1所示，共有5株共生菌對銅綠假單胞菌有抑菌活性，其中Y62抑菌活性最好，抑菌圈直徑達20.7 mm，因此選擇Y62作為候選菌株進行后續研究。

2.3 口乳桿菌Y62抑菌活性檢測結果

由圖2可見，口乳桿菌Y62對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌以及單增李斯特菌均具有一定的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性。

2.4 口乳桿菌的生長曲線測定結果

根據口乳桿菌Y62的生長曲線（圖3）顯示，該菌株對數生長期為6～24 h;穩定期為24～60 h;60 h 后進入衰亡期。

2.5 口乳桿菌的酸耐受、膽鹽耐受結果

口乳桿菌Y62的酸耐受結果見表2，菌株在pH值≥3環境內3 h后存活率均大于95%，在pH值=2環境內3 h存活率為69.8%。膽鹽耐受結果如表3所示。

2.6 口乳桿菌的藥物敏感性檢測結果

試驗所用質控菌株所產抑菌圈直徑在質控范圍內，證明本試驗所用藥品合格，口乳桿菌Y62對不同抗生素的耐藥性結果見表4。口乳桿菌Y62對所檢測的大環內酯類抗生素（紅霉素、麥迪霉素）表現出100%的敏感率，對喹諾酮類抗生素（氧氟沙星、環丙沙星）表現出100%的敏感率，對β-內酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢類）表現出78%的敏感率，對氨基糖苷類抗生素（慶大霉素、卡那霉素）表現出耐藥。

2.7 口乳桿菌的溶血性檢測結果溶血結果

由圖4可見，陽性對照顯示溶血性，口乳桿菌Y62不具有溶血活性。

2.8 口乳桿菌的細胞毒性檢測結果

細胞毒性檢測如圖5所示，口乳桿菌Y62在MOI=100時作用24 h，細胞無死亡，與培養基對照組無差異，證明其不具有細胞毒性。

3 討論

本試驗的目的在于分離來自雞腸道的共生菌，并找尋其中潛在的抑菌益生菌。健康禽類腸道分布著超過300種細菌，其中約有半數為厭氧或兼性厭氧菌，對這些細菌的分離鑒定具有較為重要的意義。乳酸菌是腸道中的優勢菌群 本次試驗結果也證實了這點，本次分離的41株共生菌中，乳酸菌共有31株，占比75.61%，而這些乳酸菌中，乳桿菌28株，占比90.32%，其中口乳桿菌僅1株。作為雞腸道中的主要乳桿菌種，本次僅分離出1株，其一可能是由于口乳桿菌主要分布在十二指腸、空腸區域，在盲腸的含量較低[8]。其二可能是在分離純化過程中，菌群的多樣性發生了變化，部分共生菌無法分離得到活菌。通過本研究分離得到的口乳桿菌，表明本研究所采取的以盲腸黏膜為來源，對不易培養共生菌進行分離純化的方法和路線是有效的，在有限的條件下可以進一步推廣應用。

口乳桿菌Y62作為雞腸道共生菌，其定植的必要條件是耐受胃腸環境，本研究的結果也證實這點。該菌對酸有較強耐受能力，在pH值=3的條件下培養3 h，存活率幾乎等于100%，在pH值=2條件下培養3 h，存活率依然高于70%，但是其對膽鹽的耐受能力較弱，在0.3%膽鹽濃度下，存活率為70.3%，低于其他乳酸桿菌，這可能是不同種屬間具有差異性導致，與先前的研究[9]相符合。

從雞腸道中分離得到的共生菌，為了后續培養以及益生性評價，對其耐藥性進行評價是十分必要的。本試驗中口乳桿菌Y62對市面上的大部分抗生素均敏感，僅對氨基糖苷類抗生素表現耐藥，無多重耐藥性。并且有研究表明，乳酸菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性表現出較大屬間差異，乳球菌屬、鏈球菌屬等對其無耐藥性，乳桿菌屬對其表現出較高的耐藥性[10]，本試驗的結果與之相符合。

腸道共生菌群除益生菌外，還有條件致病菌和致病菌，所以對口乳桿菌Y62的安全性進行評價非常重要。因為口乳桿菌Y62是從健康雞的腸道中分離，故安全性評價并未進行動物試驗，細胞試驗結果證實了它的安全性，對于未來在食品、醫藥或畜牧行業的應用是安全的。

本試驗結果表明，分離得到的嚴格厭氧口乳桿菌具有優良益生菌的益生特性，作為雞源益生菌具有較好的應用前景。

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