基于RAD-seq簡化基因組測序的西藏黃牛遺傳多樣性研究

鄧兵 晉美旺杰 任增幫 次旦歐珠 達瓦羅布 楊銳 陳仕毅 鄺良德

摘要：為在基因組水平研究西藏黃牛的遺傳多樣性，并通過選擇信號分析發掘重要種質特性基因，利用RAD-seq簡化基因組測序鑒定拉薩黃牛、阿沛甲咂牛、日喀則駝峰牛和樟木黃牛的SNP標記，計算群體遺傳結構和遺傳進化，鑒定基因組受選擇區域和受選擇基因。結果表明，共鑒定出1 355 274個SNP標記。阿沛甲咂牛和樟木黃牛遺傳多樣性最為豐富，觀察雜合度分別為0.185 6、0.164 4，核苷酸多樣性分別為0.202 2、0.202 6，拉薩黃牛和日喀則駝峰牛的遺傳多樣性相對低些。近交系數最高的為阿沛甲咂牛，而日喀則駝峰牛的近交系數最低。拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數最高（0.092 7），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數最低（-0.001 1）。聚類分析結果表明，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關系最近，而與樟木黃牛的親緣關系最遠。通過選擇信號分析，在西藏黃牛群體中檢測出22個基因組區域受到選擇，包含96個受選擇基因。GO富集分析表明，這些受選擇基因顯著富集在心血管系統發育、炎癥反應、細胞間連接、染色質結合等生物學通路。本研究從基因組水平揭示西藏黃牛的種質特性，為進一步開展西藏黃牛種質資源保護及利用提供了重要理論依據。

關鍵詞：西藏黃牛;遺傳多樣性;簡化基因組測序

中圖分類號：S823.8+12 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0153-04

西藏黃牛是西藏的主要地方家畜品種之一，集中分布于西藏農區、半農半牧區和林區，主要分布在海拔 3 000～4 200 m，且分布數量隨海拔高度的增加而減少。雅魯藏布江中下游、喜馬拉雅山東段和三江流域下游地區分布較集中，占全區黃牛總數的50%以上。西藏黃牛體型外貌以及生產性能由于分布區域的不同存在一定差異，經過長期自然選擇形成了拉薩黃牛、阿沛甲咂牛、日喀則駝峰牛、樟木黃牛等4個主要地方類群。西藏黃牛以產乳為主，乳、肉、役兼用，具有體型小、成熟晚、耐寒、耐粗飼、適應高海拔、抗逆性強等特點，是我國寶貴的地方畜禽遺傳資源[1-3]。

通過利用微衛星標記和線粒體DNA標記來進行遺傳多樣性和遺傳進化分析已經在不同品種牛上廣泛開展[4-7]，然而這些DNA標記在整個牛基因組中的覆蓋范圍是極其微小的，所代表的基因組遺傳變異信息量也是非常有限的。而新一代測序技術的出現實現了SNP分子標記的高通量檢測，為從整個基因組水平上研究牛的遺傳進化提供了準確高效的研究方法[8]。RAD-seq簡化基因組測序是通過限制性內切酶對基因組進行打斷，然后進行高通量測序從而得到大量遺傳多態性標簽序列，該技術流程簡單、費用較低，能有效降低基因組測序復雜度，目前，已廣泛應用在動物分子遺傳標記開發、群體遺傳及進化學、高密度遺傳圖譜構建等研究中[9-10]。因此，本研究利用RAD-seq簡化基因組測序對西藏黃牛4個類群的遺傳多樣性和系統進化進行研究，能為西藏黃牛遺傳保種提供科學依據，為進一步進行品種改良和優良新品種培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

以西藏黃牛的4個地方類群，即拉薩黃牛（L）、阿沛甲咂牛（J）、日喀則駝峰牛（T）和樟木黃牛（Z）為研究對象，于2020年7月在西藏拉薩、林芝、日喀則隨機采集每個類群30頭成年牛（公母各半）血液樣本，盡量避免個體間存在親緣關系，合計采集120頭成年西藏黃牛血液樣本，-20 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RAD-seq簡化基因組測序 利用天根血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-02）提取樣品基因組DNA，經質檢合格后，利用Super GBS技術[1]構建pair-end測序文庫（300～500 bp），在Illumina PE150平臺上對構建好的文庫進行RAD-seq簡化基因組測序。測序由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.2.2 SNP質控 測序結果用GATK 和Samtools程序進行SNP鑒定，質控條件為：Q20>95%，ddRAD depth>60%，SNP Call rate>90%，MAF>0.05。

1.2.3 統計方法 利用Pop Gen 軟件進行觀察雜合度（Ho）、近交系數（Fis）和群體遺傳分化系數（Fst）計算，利用Treemix軟件進行基因流（Nm）計算，利用PLINK 軟件進行連鎖不平衡（LD）分析和選擇信號檢測，利用MEGA 軟件UPGMA聚類法進行群體聚類分析。

2 結果與分析

2.1 基因組SNP標記鑒定

經過兩步法數據質控，在西藏黃牛4個類群中共鑒定出SNP 1 355 274個，其中，常染色體上鑒定出SNP 1 326 666個，性染色體上鑒定出SNP 28 588個，總體上，SNP數量與染色體長度呈正相關。

2.2 西藏黃牛不同類群遺傳多樣性分析

由表2可知，阿沛甲咂牛和樟木黃牛遺傳多樣性最為豐富，觀察雜合度分別為0.185 6、0.164 4，核苷酸多樣性分別為0.202 2、0.202 6，拉薩黃牛和日喀則駝峰牛的遺傳多樣性相對低些，核苷酸多樣性分別為0.191 6、0.198 5，與LD連鎖不平衡分析結果（圖1）相一致。近交系數最高的是阿沛甲咂牛，為0.092 7，日喀則駝峰牛的近交系數最低，為0.078 2。

2.3 西藏黃牛不同類群遺傳進化分析

西藏黃牛不同類群遺傳分化系數（Fst）和基因流（Nm），由表3可知，拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數最高（0.092 7），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數最低（-0.001 1），相對應的，拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的基因流最高（0.021 0），而樟木黃牛和阿沛甲咂牛之間的基因流最低（-0.000 3）。UPGMA 聚類結果，由圖2可知，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關系最近，而與樟木黃牛的親緣關系最遠。

2.4 西藏黃牛群體選擇信號分析

結合核苷酸多樣性比率（Pi）和遺傳分化系數（Fst）的選擇信號分析發現，22個基因組區域受到選擇，共有96個受選擇基因。由圖3可知，功能分析結果受選擇基因主要富集在心血管系統發育（VSIG8、TEK、ADM、HOPX）、炎癥反應（CCL24、VSIG8、CCL26）、細胞間連接（TEK、SLAMF8、KDR）、染色質結合（KLF8、MAK、MCMBP、CCNT2）等生物學通路。

3 討論

3.1 西藏黃牛群體基因組SNP鑒定和遺傳多樣性

本研究通過簡化基因組測序在西藏黃牛4個地方類群中共鑒定出1 355 274個SNP位點，主要分布在1～19號常染色體上，且數量均在40 000個以上 說明西藏黃牛群體具有豐富的遺傳多樣性。本試驗克服了微衛星標記和線粒體DNA技術在基因組上覆蓋度較低的缺點，為從基因組水平進行西藏黃牛遺傳進化和關聯分析奠定了基礎，也為構建西藏黃牛SNP芯片提供了必要條件。

在西藏黃牛不同類群中，阿沛甲咂牛遺傳多樣性最豐富，觀察雜合度為0.185 6，核苷酸多樣性為0.202 2。同時，其近交系數最高為0.092 7，提示在阿沛甲咂牛的保種和選種過程中應嚴格控制近交系數的過快增加，維持群體遺傳多樣性的相對穩定。而拉薩黃牛的遺傳多樣性最低，觀察雜合度為0.179 9，核苷酸多樣性為0.191 6。總體來看這與LD連鎖不平衡分析結果相一致。拉薩黃牛與日喀則駝峰牛之間的遺傳分化系數最高（0.092 7），說明兩者之間存在中等程度的遺傳分化，而拉薩黃牛與樟木黃牛以及阿沛甲咂牛之間的遺傳分化系數分別為0.008 5、0.010 1，遺傳分化系數較小。UPGMA聚類分析表明，日喀則駝峰牛和阿沛甲咂牛之間的親緣關系最近，而與樟木黃牛的親緣關系最遠。總體上，遺傳聚類分析結果與西藏黃牛4個地方類群間遺傳分化、基因流以及地理分布相一致。

3.2 西藏黃牛群體選擇信號

大量研究表明，在動物進化過程中，無論是先天自然選擇，還是后天人工選擇都會在動物基因組上留下選擇信號，受到選擇區域會產生高度遺傳分化。因此，進行選擇信號分析有助于進一步了解基因組遺傳分化對動物表型的影響，發掘篩選出影響動物性狀的重要的功能基因。目前，國內外學者利用基因組測序或基因芯片技術已經在豬、羊、雞等畜禽上開展了選擇信號研究，發掘出大量種質特性基因和經濟性狀相關基因[11-14]。針對牛而言，Zinovieva等利用高密度SNP基因分型芯片對2個俄羅斯本地牛品種進行選擇信號研究，檢測出了新的基因組受選擇區域和受選擇候選基因[15]。Ben-Jemaa 等利用SNP芯片對北非牛進行基因組選擇信號研究，確定了36個受選擇的基因組區域，篩選到了GH1、ACE、ASIC3、HSPH1等與炎熱相關的受選擇基因[16]。Mariadassou等利用全基因組測序對利木贊牛進行選擇信號研究，找到了57個受選擇基因組區域以及68個受選擇候選基因，其中包括MSTN、NCKAP5、RUNX2等可能與利木贊牛重要表型性狀相關的基因[17]。Xia等利用全基因組測序評估了中國郟縣紅牛基因組多樣性和選擇信號特征，采用FST方法找到了17個受選擇基因，這些基因可能與郟縣紅牛的飼料轉化率（CCSER1）、肉品質性狀（ROK2、PPP1R12A、CYB5R4、EYA3、PHACTR1）、生育能力（RFX4、SRD5A2）和免疫應答（SLAFF1、CD84和SLAFF6）密切相關[18]。呂世杰等通過簡化基因組測序對中國南陽牛和安格斯牛進行選擇信號分析，篩選得到33個受選擇基因組區域，其中，16個基因組區域與生長性狀相關QTLs重合，找到了4個基因（FXR1、ADAR、IGF1和MNF1）與骨生長、肌肉發育和生長調控有關[19]。

在青藏高原上，缺氧是影響動物機體生長發育的主要因素，生活在青藏高原上的西藏黃牛具有耐寒、耐粗飼、適應高海拔、抗逆性強的特點。本試驗中，通過選擇信號分析在西藏黃牛群體中發現22個基因組區域受到選擇，找到了VSIG8、TEK、ADM、HOPX等4個顯著富集在心血管系統發育的受選擇基因，而心血管系統發育與動物對高海拔缺氧環境的適應性密切相關。因此，這4個受選擇基因極有可能是西藏黃牛對高海拔適應性的候選基因。其中HOPX基因已被證實在心臟發育和心肌細胞增殖中發揮著重要作用[20-21]，而ADM基因參與血管系統調節[22]，VSIG8和TEK在心血管系統中的作用尚未證實，需要進一步研究。同時，與炎癥反應相關的基因CCL24、VSIG8、CCL26也受到了選擇，CCL24和CCL26是趨化性細胞因子家族成員，能夠促進動物體內炎癥部位的各種白細胞的補充、激活及黏附[23]。推測CCL24、VSIG8、CCL26這3個基因與西藏黃牛的抗逆性強相關，因而在進化上受到選擇。

4 結論

綜上所述，本研究利用簡化基因組測序準確揭示了西藏黃牛4個類群基因組水平的遺傳多樣性和系統進化，選擇信號分析表明，選擇作用主要集中在高海拔適應性、抗逆性等方面的塑造。該研究結果進一步為西藏黃牛種質資源的保護及利用提供了重要參考依據。

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