體外擴增人CD34+造血干/ 前體細胞培養方法的研究

吳 凡 謝鈺珍 封 怡 焦天賜

(蘇州工業園區服務外包職業學院，江蘇 蘇州 215123)

造血干細胞(HSC)是具有永生能力和自我更新能力的一種血細胞，主要包括髓樣、紅系和淋巴細胞的祖細胞。其生物學功能廣泛，具體表現在臨床方面，對于HSC 的研究涉及細胞治療、基因治療、腫瘤治療、血液病和遺傳病等多個方面。如今HSC 的主要來源，是動員的外周血、骨髓、胎盤和臍帶血。由于這些供體中可使用的HSC 數量有限，較為珍貴，因此迫切需要使用體外擴增技術以獲得大量可移植的HSC 來滿足臨床上的需求。

體外擴增研究大多數都集中在內因或者是環境誘導介導的HSC 的更新和存活過程，通過與永生化基質細胞、骨髓間充質基質細胞或過度表達自我更新基因共同實現了合理化干細胞擴增。但是，這些方法面臨對基質環境的操作或者對造血干細胞基因組的擾動等因素的干擾，且增加了一些如患癌等意外風險，同時離體培養HSC 成本較高，這些因素阻礙了HSC 的工業化培養和臨床使用。本文研究目的在于建立一種簡單有效、能夠降低受體患病風險、且能夠降低成本的細胞體外擴增方法，來滿足臨床對于造血干細胞的需求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

由蘇州大學附屬醫院提供的外周血，血樣樣本要求：健康供體、無其他疾病。抽取后血液在4℃保存并運輸到實驗室。之后操作均在生物安全柜中進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血細胞分選

1.2.1.1 在50mL 的離心管1 中加入2mL 富集后的新鮮外周血，再加入含有2.5%胎牛血清的PBS(以下簡稱F-PBS)補足30mL；另取一支50mL 的離心管2，加入15mL 的Ficoll 液體，將在離心管1 中稀釋的外周血全部緩慢加入到離心管2 中，加入過程中離心管傾斜放置。將離心管2 垂直放入離心機，升速調至6、降速調至5，常溫下1900 rpm 離心12 min，離心結束后管內溶液分為上中下三層。用移液槍緩慢吸取中間的白膜層，轉移到新的50mL 離心管，加入F-PBS 補齊至30mL，再次離心，4℃、1900 rpm 離心5min，結束后棄去上清；再次加入F-PBS 至30mL，4℃、1900 rpm 離心5min 后棄去上清。在管中加入500 μL 的F-PBS 重懸細胞，進行細胞計數。

1.2.1.2 在上述得到的細胞懸液中加入2g CD34+磁珠及FCR Blocking，用槍頭輕輕吹打細胞，充分混勻，注意避免產生氣泡。將混合液置于4℃冰箱避光孵育30min，孵育結束后加入30mL 的F-PBS，在4℃條件下1900rpm 離心5 分鐘，去除未與細胞結合的磁珠。管中加入500μL 的分選buffer 進行重懸后，將溶液置于已消毒、潤洗的分選磁柱中進行分離，結束后再加入3 mL 分選buffer 進行沖洗，重復三次。將分選磁柱內芯從磁架上取下，放入15mL 離心管中，重新加入6mL 分選buffer，用推子快速推動，使細胞全部落入離心管中。得到的細胞懸液在4℃、1900rpm 離心5 分鐘，棄去上清，使用1mL 培養液重懸，臺盼藍染色計數。

1.2.2 造血干細胞培養過程中添加細胞因子

1.2.2.1 MS5 細胞經復蘇傳代后，加入D2.5(DMEM+2.5%FBS)洗滌，4℃下1900rpm 離心5 分鐘，去除上清后用1mL 的D10(10%FBS+DMEM)重懸細胞，計數后，取3×106的細胞加入新的15mL 離心管，加入培養基將容積補滿1mL，再加入1mL 濃度為10ng/mL 的絲裂霉素C，37℃孵育3 小時，結束后用15mLPBS 溶液清洗并離心兩次。重懸細胞后調整細胞密度至0.25M。

1.2.2.2 在96 孔板中，每個孔里加入100μL 的細胞懸浮液，過夜培養，去除上清后按表1 設置三個培養組，每組3 個復孔，各組添加不同細胞因子，細胞培養到第七天進行細胞計數觀察。

表1 各組添加的細胞因子組合表

1.2.2.3 細胞培養第七天，加入PE 對CD34+細胞進行染色，對CD38+細胞使用APC 染色，4℃避光孵育半小時，放入流式細胞儀檢測。

1.2.3 優化細胞因子濃度

根據1.2.2 結果，選擇組合結果佳的一組，調整細胞因子濃度(表2)，培養七天后，加入PE 對CD34+細胞進行染色，對CD38+細胞使用APC 染色，4℃避光孵育半小時，放入流式細胞儀檢測。同時使用臺盼藍對造血干細胞增殖總數及CD34+細胞進行計數，并計算擴增倍數。

表2 細胞因子濃度組合

根據細胞增殖記錄、擴增倍數以及CD34+造血干細胞的純度，篩選最佳的細胞因子濃度組合。

1.2.4 觀察Feeder cell 對培養體系的影響

在1.2.3 基礎上，設置添加Feeder cell 的實驗組(F)和不添加對照組(G)，培養造血干細胞，七天后檢測細胞增殖記錄、擴增倍數以及CD34+造血干細胞的純度，研究Feeder cell 對培養結果的影響。

2 結果與分析

2.1 分組添加細胞因子后結果

各組如表1 添加細胞因子組合后，細胞培養7 天，計數結果及細胞擴增倍數來看，C 組細胞擴增七天后達到2.29M，共擴增76.5 倍，細胞總數和擴增倍數明顯高于其他兩組。

據圖1、圖2 分析可得，C 組造血干細胞中CD34+比例最高，可達到62.1%，且CD38+比例最低，僅為4.66%，CD34+細胞量最多，且CD34+細胞擴增倍數最大；B 組造血干細胞中CD34+比例略低，為53.4%，而CD38+比例較高，為5.5%，且CD34+細胞量及擴增倍數均低于C；A 組造血干細胞中CD34+比例最低，僅為37.3%，CD38+比例最高，為8.81%，CD34+細胞量及擴增倍數為三組最低，由于本實驗為CD34+造血干細胞培養體系，而CD38+為定向祖細胞，并非目標細胞群體，因此根據細胞擴增及流式染色結果可以看出，C 組為培養造血干細胞最適細胞因子組合，即FLT3L 50ng/ML，SCF 30 ng/ML，IL-3 10 ng/ML，IL-6 15ng/ML。

圖1 三組細胞培養后CD34+細胞流式染色圖(四象限：Q1 為CD38+陽性與CD34+陰性，Q2 為CD38+陽性與CD34+陽性，Q3 為CD38+陰性和CD34+陽性，Q4 為CD38+陰性和CD34+陰性)

圖2 培養后第七天各組CD34+細胞計數(A)與擴增倍數(B)統計

2.2 細胞因子濃度優化后結果

三組細胞在不同細胞因子濃度條件下(表2)，培養七天后，F 組細胞量達到2.45M，7 天共擴增81.7 倍，是三組中細胞量及擴增倍數最高的一組。

流式染色顯示，調整造血干細胞培養體系中的細胞因子濃度，F 組造血干細胞中CD34+比例最高，可達到83.1%，且CD38+比例最低，僅為4.98 %，CD34+細胞量最多，且CD34+細胞擴增倍數最大；E 組造血干細胞中CD34+比例略低，為78.3%，CD38+比例較高，為5.09%，且CD34+細胞量及擴增倍數均低于F；D 組造血干細胞中CD34+比例最低，僅為63.1%，CD38+比例最高，為5.19%，且CD34+細胞量及擴增倍數為三組最低(圖3、圖4)。由于本實驗為CD34 造血干細胞培養體系，而CD38+為定向祖細胞，并非目標細胞群體，因此根據細胞擴增及流式染色結果可以看出，在含有MS5 feeder cell的情況下，F 組中的細胞因組合是培養造血干細胞最適細胞因子 組 合， 分 別 為 FLT3L 100ng/ML，SCF 30 ng/ML，IL-3 10ng/ML，15ng/ML。

圖3 改變細胞因子濃度后各組細胞計數(A)及擴增倍數(B)統計圖

圖4 改變細胞因子濃度后三組細胞CD34+流式染色結果

2.3 feeder cell 對造血干細胞培養體系的影響

F 組添加feeder cell 培養七天后，總細胞量達到2.56M，擴增倍數85 倍，較未添加feeder cell的G 組細胞量和擴增倍數明顯增高。兩組細胞進行流式染色后，圖6 結果顯示，F 組造血干細胞中CD34+比例最高，可達到85.7%，且CD38+比例最低，僅為3.76 %，CD34+細胞量最多，且CD34+細胞擴增倍數最大；G 組造血干細胞中CD34+比例低，為46%，CD38+比例較高，為6.29%，且CD34+細胞量及擴增倍數均低于F 組；因此根據細胞擴增及流式染色結果可以看出，在培養造血干細胞過程中，添加feeder cell 有利于細胞生長。

圖5 改變feeder cell 添加條件后兩組細胞CD34+流式染色結果

圖6 改變feeder cell 添加條件后兩組CD34+細胞計數(A)與擴增倍數(B)統計

3 結論與討論

本實驗研究的人CD34+細胞在科研研究過程中需求量大，一直處于供應相對緊張的狀態，而細胞獲取途徑有限，因此建立合適的體外擴增培養體系是非常必要的。本次實驗通過調整培養基中的細胞因子組合、濃度以及有無基質細胞三方面來優化CD34+造血干/前體細胞的體外擴增條件。經實驗確定，在使用細胞因子及濃度分別為FLT3L 100ng/mL、SCF 30ng/mL、IL-3 20ng/mL、IL-6 15ng/mL 的條件下，添加基質細胞feeder cell 可作為人CD34+HSPC 的最佳體外擴增方案。

CD34+在臨床實驗研究和應用方面發揮著舉足輕重的作用，在多種疾病的治療研究方案中都有采用。但CD34+HSPC 多數存在于臍帶血、動員的外周血和胎盤、骨髓中，來源或多或少存在一些缺陷，無法保證來源穩定可靠，且移植較為困難，對成人患者、造血干細胞需求量大的患者較難滿足治療需要。本實驗研究結果對CD34+HSPC 在體外高效擴增提供了一個可行性較高的方案，待成熟完善后，可以實現體外大量且無毒副作用的細胞擴增，能夠解決部分血液病或者遺傳病的治療問題，造福人類。