多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白對尖孢炭疽病菌的抑制作用

田 歌，韓玉虎，Gregori R，周柏玲

（1.山西農業大學功能食品研究院，山西太原030031；2.山西農業大學果樹研究所，山西太原030031；3.加州大學植物科學系，美國加州戴維斯95616）

在果實的病理性軟化過程中，病原真菌的水解酶導致果實的細胞壁降解和軟化，同時，果實會發生應激反應以抵御病原菌的入侵。如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）[1]與病原真菌內源多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）形成一種高親和復合物，從而抑制endo-PG的部分活性[2]，減少對植物細胞壁的降解，減緩病原真菌的生長繁殖速度。有關PGIP的結構、性質、功能等方面國內外學者已進行了廣泛、深入的研究[3]。PGIP是一種含有富亮氨酸重復區域的蛋白質，能夠抑制多種真菌的多聚半乳糖醛酸酶的活性，干擾灰霉菌等多種真菌病害對植物組織的侵染過程，從而抑制真菌病害的發生。但有關蘋果PGIP抑制尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）的研究報道較少。

丹霞蘋果是山西省農業科學院自主選育的晚熟蘋果新品種，具有易成花、早豐產、品質優、易管理等優良特性，其獨特風味和濃郁香氣深受果農和消費者的青睞，在山西大規模栽種，也是華北、西北蘋果主產區的主栽品種之一[4]。但在果實采后貯藏中后期，由尖孢炭疽菌侵染致丹霞蘋果軟腐病發生嚴重，給果農帶來重大損失。

本試驗在前人有關PGIP研究的基礎上，從丹霞蘋果果實病斑提取、篩選、培養尖孢炭疽菌，測定尖孢炭疽菌病菌活性，同時從丹霞果實健康組織中提取PGIP，檢測PGIP對尖孢炭疽菌水解酶半乳糖醛酸酶（PG）的抑制作用，從細胞水平研究丹霞蘋果自身所具備的抑制尖孢炭疽菌感染的抗病因子，探索預防尖孢炭疽菌感染的新思路，旨在為防治蘋果軟腐病提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試蘋果品種丹霞由山西省農業科學院果樹研究所選育，成熟期收獲后在4℃下貯藏。

改良普拉特培養基（PM）[5]包含:13.6 g KH2PO4，4 g NH4NO3，1.25 g MgSO4·7H2O，0.02 g FeSO4·7H2O，0.001 g CuSO4·5H2O，0.002 g ZnSO4·7H2O，0.001 3 g（NH4）2MoO4，0.016 g MnSO4·H2O，0.028 g H3BO3，定容至1 L。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）購自美國西格瑪公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 尖孢炭疽菌分生孢子懸浮液的制備 從蘋果的感染組織中分離出尖孢炭疽菌，并在PDA上培養10 d，然后用無菌蒸餾水沖洗菌落制備病原菌分生孢子懸浮液，濃度為1×103個/mL。

1.2.2 尖孢炭疽菌的液體培養 用1 mol/L鹽酸將PM培養基pH值調節至4.5，取9 mL培養基分裝到15 mL試管中，而后在121℃下高壓滅菌15 min。每個試管加入1 mL（濃度為1×103個/mL）尖孢炭疽菌的分生孢子懸浮液接種。在20℃下搖培14 d。

1.2.3 尖孢炭疽菌分泌蛋白質（PECA）提取 將尖孢炭疽菌的培養液離心（13 000×g，30 min），回收上清液（約5 mL）并添加1 mL緩沖液（0.05 mol/L NaCl和0.1 mol/L乙酸鈉，pH值5），再次離心（13 000×g，30 min）。收集上清液并過濾2次：第1次用微孔玻璃過濾器（密理博），第2次用微孔膜過濾器（0.45 μm）。將濾液用透析膜管（6.000-8.000 MWCO，Spectrapor）透析過夜（4℃，0.1 mol/L乙酸鈉，pH值5），從PM中提取的尖孢炭疽菌蛋白質在4℃下儲存至使用[5]。試驗設置3個重復。

1.2.4 蘋果健康組織蛋白質（PEHT）提取 取6 g丹霞蘋果果實，在緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉，pH值5，1%聚乙烯吡咯烷酮和1 mol/L NaCl）中均質提取蛋白質[6]。在4℃下勻漿1 h后在4℃下13 000×g離心5 min，并按1.2.3進行過濾、透析和濃縮。蛋白質提取物（PEHT）在4℃下儲存，次日使用[7]。

1.2.5 多聚半乳糖醛酸酶的活性分析

1.2.5.1 瓊脂糖徑向擴散法 將1.5 g瓊脂糖、10 mg多聚半乳糖醛酸（PGA，Fluka）和0.365 g乙二胺四乙酸加入150 mL0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5），加熱溶解，倒入23 cm×23 cm有機玻璃框中，冷卻凝固后使用[8]。

用軟木鉆在瓊脂片上打直徑為4 mm的孔。每孔加樣15 μL（PECA和PEHT），并在37℃下培養過夜。用釕紅（0.05%（m/V），Fluka）染色，用樣孔周圍未染色（區域暈）面積來評估多聚半乳糖醛酸酶的活性。以黑曲霉的果膠酶（Sigma）作為標準多聚半乳糖醛酸酶陽性對照[9]，水和0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5）為陰性對照。每樣3個重復。

1.2.5.2 分光光度法 反應混合物（Reaction Mixture，RM）的制備：將50 μLPECA加入3 mL0.1%PGA和3 mL乙酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH值5）中，在30℃水浴中孵育反應，添加蘋果健康組織蛋白質（PEHT）提取物進行消化。在0（添加酶后立即）～28 h的不同時間間隔內，每隔2 h取200 μL的RM等分樣品，添加1 mL 0.1 mol/L硼酸鈉（pH值9.6）中止反應。然后分別添加300 μL的1%2-氰基乙酰胺試劑溶液，煮沸10 min后在276 mm處測量吸光度（島津UV-2401PC）。以半乳糖醛酸不加PECA和PEHT為標準曲線[10]。

1.2.6 PGIP抑制活性的測定 取7.5 μL尖孢炭疽菌分泌的蛋白質（PECA）分別添加在醋酸緩沖液稀釋（Ⅰ）、煮沸PEHT（Ⅱ）、新鮮PEHT（Ⅲ），以熱失活PEHT作為陰性對照。每個處理設置3個重復。

1.2.7 尖孢炭疽菌的接種試驗 用不銹鋼刀在丹霞蘋果中部劃口（3 mm×3 mm×3 mm），在傷口處接種20 μL尖孢炭疽菌分生孢子懸浮液[11]。室溫下靜置1 h，在傷口處注入等量的蒸餾水（尖孢炭疽菌＋H2O）、醋酸鹽緩沖液（尖孢炭疽菌＋buffer，0.1 mol/L，pH值5）、PEHT（尖孢炭疽菌＋PEHT），分別用蒸餾水（H2O＋H2O）和PEHT（PEHT＋H2O）處理的果實作陰性對照和陽性對照。

接種處理后，將試樣放在20℃和相對濕度較高的環境下，每個處理2個重復（第1年、第2年）。接種后第4天開始記錄病斑面積（mm2），連續記錄7 d。然后計算PEHT抑制尖孢炭疽菌病斑面積的縮小程度。

1.3 數據分析

所有數據均進行單因素方差分析。采用Fisher's LSD檢驗分離平均值（P≤0.05）。使用統計軟件包Statistica for windows處理數據。數據分析前，用Bartlett檢驗進行方差顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性檢測

瓊脂糖徑向擴散分析結果顯示（圖1），在加載尖孢炭疽菌的樣孔周圍有一個清晰的區域（光暈）（孔3），陰性對照組（緩沖液和水）或健康組織的蛋白質提取物PEHT中未觀察到活性，表明尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性良好[10]。

分光光度檢測結果顯示，尖孢炭疽菌的多聚半乳糖醛酸酶在28 h內基本完成消化，并且在培養8～20 h期間表現高度線性相關（R2＝0.995 6）。根據16 h的測定結果，酶活性為3.2×104μg/（mg·h）（圖2）。進一步驗證了尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好。

2.2 丹霞蘋果蛋白提取物PEHT對尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶PG的抑制

在尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好的情況下，添加從健康丹霞蘋果中提取的蛋白質PEHT，反應結果在瓊脂糖徑向擴散分析顯示，光暈明顯縮小（超過65%）（P≤0.001 9）（圖3），表明PEHT對尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶的活性有明顯的抑制作用。

2.3 PGIP抑制尖孢炭疽菌接種試驗

在新鮮丹霞果實上接種尖孢炭疽菌，結果顯示，接種4 d后所有果實均出現腐爛，第4天和第10天的病斑面積分別為36.01、861.32 mm2（表1，第1年）。然而，在接種傷口處添加PEHT，對尖孢炭疽菌的侵染產生了明顯的抑制作用。在接種初期，PGIP對尖孢炭疽菌的抑制性很強，接種后第4天，抑制率可達到54.5%。隨著接種時間的延長，PGIP對尖孢炭疽菌的抑制性逐漸降低，接種后第10天抑制率降為27.9%（表2，第1年）。第2年結果與第1年結果相似。綜上所述，在PEHT中存在抑制尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶活性的PGIP。

表1 丹霞蘋果蛋白提取物（PEHT）對尖孢炭疽病的抑制作用

表2 PGIP對尖孢炭疽菌的抑制率 %

3 結論與討論

前人研究報道了PGIP存在于柑橘[12]、葡萄柚[13]和豆類[14]中，表明其具有抗病特性。PARK等[15]研究發現，多聚半乳糖醛酸酶活性與衰變的嚴重程度與病斑直徑呈正相關，表明這種酶在病害發展過程中作為一種毒力因子發揮作用。在番茄[16]、蘋果[17]和覆盆子[18]等物種中，PGIP主要在果實組織中表達，而在豆類等物種中，PGIP可在植物的營養體部分和其他組織中表達[19]。

在本試驗中，針對丹霞蘋果果實易染尖孢炭疽菌的特點，通過檢測丹霞蘋果果實PGIP對尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的抑制試驗和接種試驗，探明丹霞蘋果果實內部具有抑制尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的PGIP蛋白，并對尖孢炭疽菌的侵染具有抑制作用。

前人研究表明，外源PGIP基因的引入增強了柿子對灰霉病菌的抗病性[20]，并且POWELL等[8]在實驗室發現，轉PGIP基因的番茄植株中灰霉病有所減少。本研究表明，PGIP在丹霞蘋果果實抵抗尖孢炭疽菌侵入方面有潛在防御作用。深入研究蘋果果實中PGIP抗病活性成分及抗病機制以及應用生物技術和基因工程技術人工調控蘋果PGIP水平，最大限度抑制由尖孢炭疽菌導致的果實腐爛，為農作物真菌病害的防控奠定基礎。