羊棲菜多糖通過調(diào)控miR-29b-5p/AQP9表達(dá)對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的影響及機(jī)制

廖忠正 貝箏 俞容 吳小曇 楊國(guó)正

(1海南省干部療養(yǎng)院(海南省老年病醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 571100；2海南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣、數(shù)量最多的一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其氧化損傷與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔1,2〕。羊棲菜多糖(SFPS)是從羊棲菜中提取出來的水溶性多糖，有較強(qiáng)的抗氧化能力〔3〕。已有研究報(bào)道SFPS能通過激活JNK/Nrf2/ARE信號(hào)通路，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力，延緩小鼠的衰老〔4〕。SFPS還能在一定程度上減輕肝細(xì)胞L02脂肪變性時(shí)的氧化損傷、減少細(xì)胞凋亡〔5〕。miRNA是一類非編碼RNA，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-29家族可通過減輕氧化應(yīng)激從而保護(hù)深低溫停循環(huán)介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷〔7〕。且還有研究報(bào)道心肌缺血再灌注后miR-29b表達(dá)水平下降，上調(diào)miR-29b可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡、組織心室重塑、保護(hù)心臟功能〔8〕。但SFPS和miR-29b-5p對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過用過氧化氫(H2O2)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞建立氧化模型，研究SFPS和miR-29b-5p對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；SFPS購(gòu)自珠海市雙博杰科技有限公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體、兔抗人酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗體、兔抗人水通道蛋白(AQP)9多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；RIPA裂解液、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶(AV-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京碧云天生物公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；miR-NC、miR-29b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-29b-5p載體質(zhì)粒均購(gòu)自金瑞斯生物科技公司。

1.2方法

1.2.1分離培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞 SPF級(jí)新生SD大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，將新生SD大鼠消毒，無菌條件下取出大腦用D-Hanks緩沖液漂洗，用剪刀將大腦皮質(zhì)剪碎后用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，過濾，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基，離心棄上清，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90 %左右時(shí)進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為3～5代內(nèi)。

1.2.2藥物處理和分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照(Con)組、過氧化氫(H2O2)組、SFPS低、中、高濃度CSFPS-L、SFPS-M、SFPS-H組，Con組為正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞；H2O2組為200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)處理24 h；用終濃度分別為15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L的SFPS培養(yǎng)液預(yù)處理24 h后用200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)處理24 h，分別計(jì)為H2O2+SFPS-L、H2O2+SFPS-M、H2O2+SFPS-H。將miR-NC、miR-29b-5p轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞后用200 μmol/L H2O2再誘導(dǎo)處理24 h，記為H2O2+miR-NC組、H2O2+miR-29b-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-29b-5p轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞后用60 mg/L的羊棲菜多糖培養(yǎng)液處理24 h后再用200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)處理24 h，分別計(jì)為H2O2+SFPS+anti-miR-NC組、H2O2+SFPS+anti-miR-29b-5p組。

1.2.3MDA、SOD、GSH-Px試劑盒分別檢測(cè)MDA水平、SOD、GSH-Px活性 收集培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行操作分別檢測(cè)MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

1.2.4Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2、酶切caspase-3、AQP9蛋白表達(dá)水平提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后取40 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)膜，用5 %脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育90 min，顯影后用Quantity One分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，按照試劑盒說明書，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-29b-5p和AQP9 mRNA表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-29b-5p和AQP9分別以U6和GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-29b-5p上游引物序列：5′-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3′，下游引物序列：5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；AQP9上游引物序列：5′-CCAGCTCCATTCATATCCAC-3′，下游引物序列：5′-CTAATGACAACAGGCTCCAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3′，下游引物序列：5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′。

1.2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29b-5p對(duì)AQP9的靶向調(diào)控 將AQP9的熒光素酶表達(dá)載體(WT-AQP9和MUT-AQP9)分別與miR-NC和miR-29b-5p轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞中，按試劑盒說明書操作檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。將miR-NC、miR-29b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-29b-5p轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細(xì)胞中后用RT-qPCR檢測(cè)miR-29b-5p表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，Bax、酶切caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均P<0.05)；與H2O2組相比，不同濃度SFPS組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，Bax、酶切caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率均顯著降低，且均呈濃度依賴性(均P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

1～4：Con組，H2O2組，H2O2+SFPS-L組，H2O2+SFPS-M組，H2O2+SFPS-H組圖1 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

2.2SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px活性顯著降低(均P<0.05)；與H2O2組相比，不同濃度SFPS組星形膠質(zhì)細(xì)胞中MDA含量逐漸降低，SOD、GSH-Px活性顯著升高，呈濃度依賴性(均P<0.05)。見表1。

2.3SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p和AQP9表達(dá)的影響 與Con組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p表達(dá)水平顯著降低，AQP9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)；與H2O2組相比，不同濃度SFPS糖組星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p表達(dá)水平顯著升高，AQP9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且均呈濃度依賴性(均P<0.05)，見圖3，表2。

1～4：Con組，H2O2組，H2O2+SFPS-L組，H2O2+SFPS-M組，H2O2+SFPS-H組圖3 Western印跡檢測(cè)AQP9蛋白的表達(dá)

2.4miR-29b-5p靶向調(diào)控AQP9的表達(dá) TargetScan預(yù)測(cè)顯示AQP9與miR-29b-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。miR-29b-5p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見表3。相較于miR-NC組AQP9蛋白表達(dá)水平(0.44±0.04)，miR-29b-5p組(0.21±0.03)顯著降低；相較于anti-miR-NC組AQP9蛋白表達(dá)水平(0.43±0.03)，anti-miR-29b-5p組(0.89±0.07)顯著升高(均P<0.05)。見圖5。可見，miR-29b-5p可靶向調(diào)控AQP9的表達(dá)。

圖4 AQP9的3′UTR中含有與miR-29b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組，miR-29b-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-29b-5p組圖5 miR-29b-5p靶向調(diào)控AQP9的表達(dá)

2.5miR-29b-5p過表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的影響 與Con組相比，H2O2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中 miR-29b-5p表達(dá)水平顯著降低，AQP9表達(dá)水平顯著升高，MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px 活性顯著降低，Bcl-2水平顯著降低，Bax水平和細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與H2O2+miR-NC組相比，H2O2+miR-29b-5p組星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p表達(dá)水平顯著升高，AQP9表達(dá)水平顯著降低，MDA水平顯著降低，SOD、GSH-Px活性顯著升高，Bcl-2水平顯著升高，Bax水平和細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)，見圖6，表4，圖7。

1～4：Con組，H2O2組，H2O2+miR-NC組，H2O2+miR-29b-5p組圖6 miR-29b-5p過表達(dá)對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

圖7 miR-29b-5p過表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

2.6干擾miR-29b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SFPS(60 mg/L)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的作用 與H2O2組相比，H2O2+SFPS組星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p水平顯著升高，AQP9水平顯著降低，MDA水平顯著降低，SOD、GSH-Px活性顯著升高，Bcl-2水平顯著升高，Bax水平及細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與H2O2+SFPS+anti-miR-NC組相比，H2O2+SFPS+anti-miR-29b-5p組星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p水平顯著降低，AQP9水平顯著升高，MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px活性顯著降低，Bcl-2水平顯著降低，Bax水平及細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖8，圖9，表5。

1～4：H2O2組，H2O2+SFPS組，H2O2+SFPS+anti-miR-NC組，H2O2+SFPS+anti-miR-29b-5p組圖8 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖9 干擾miR-29b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

氧化損傷在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要作用，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞功能，從而影響相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生〔9〕。已有研究證實(shí)SFPS可保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡〔10〕。SFPS還能明顯減輕高糖對(duì)胰島βTc3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，并明顯降低Bax和caspase-3基因表達(dá)〔11〕。SFPS能提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA和活性氧簇(ROS)水平，減輕H2O2對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的氧化損傷，有較好的抗氧化保護(hù)作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SFPS能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)H2O2對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷，且可能有濃度依賴性。

有研究報(bào)道m(xù)iR-29b可通過負(fù)調(diào)控p53依賴性凋亡途徑減輕腦缺血性損傷〔13〕；而α硫辛酸通過抑制miR-29b表達(dá)保護(hù)成纖維細(xì)胞避免氧化損傷〔14〕。miR-29b通過靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明過表達(dá)miR-29b-5p可抑制H2O2引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用。且SFPS處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-29b-5p表達(dá)水平顯著升高，干擾miR-29b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SFPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。提示SFPS可能通過上調(diào)miR-29b-5p表達(dá)保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷。

AQP9是一種跨膜蛋白，星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后AQP9 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，提示AQP9可能參與損傷性腦水腫的形成〔16〕。AQP9在帕金森病腦組織中高表達(dá)，與其發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)〔17〕。AQP9過度表達(dá)與缺血后腦損傷逐漸加重密切相關(guān)〔18〕。說明AQP9可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SFPS可能通過miR-29b-5p調(diào)控AQP9影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡。