解淀粉芽孢桿菌S-2發(fā)酵優(yōu)化及培養(yǎng)特征研究

魏鴻剛

摘要：在農(nóng)業(yè)上以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為有效成分的農(nóng)藥和肥料應(yīng)用越來(lái)越廣泛。因此以活菌含量和芽孢率為目的，考察了碳源、氮源、pH、接種量對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，采用如下發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：5% 大米粉、2% 豆粕粉、0.05%KH2PO4，0.005%MnSO4， pH6.5-7.5，接種量 1%，培養(yǎng) 48h 時(shí)最高活菌含量可達(dá) 37.7×108cfu/mL，芽孢率可達(dá) 95.4%。此外， 耐鹽試驗(yàn)表明，S-2 最高能耐受 6% 的NaCl，耐鹽度高，可在鹽堿地或高鹽的污水處理中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌，活菌含量，芽孢率，耐鹽

Abstract： Bacillus amyloliquefaciens has been widely used as the active ingredient in agricultural pesticides and fertilizers. Therefore， the content of bacteria and spore rate in fermentation broth were used as indexes to investigate the effects of carbon source， nitrogen source， pH and inoculation amount on the culture results. The results showed that the optimal medium for fermentation of Bacillus amyloliquefaciens S-2 was 5% rice flour， 2% soybean meal powder， 0.05%KH2PO4， 0.005%MnSO4， the initial pH of fermentation was 6.5-7.5， and the inoculation amount was 1%.The maximum content of bacteria and spore rate reached 37.7×108cfu/mL and 95.4% when the medium was used for 48h. In addition， salt resistance test results show that S-2 can tolerate the highest 6% NaCl， can be used in saline alkaline land or high salt wastewater treatment.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens， content of bacteria， spore rate， salt tolerance

解淀粉芽孢桿菌是一種環(huán)境友好的好氧型革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌， 菌體呈桿狀，產(chǎn)芽孢，并能減免毒理學(xué)資料 [1]。該菌分布廣泛，在植株、灘涂、海水里都能分離得到。由于該菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)（如抗生素、抑菌蛋白、脂肽類(lèi)等），且對(duì)多種植物病原細(xì)菌和真 ?菌（如青枯病、角斑病、枯萎病、根腐病、稻瘟病、紋枯病等）具 有明顯的拮抗或抑制作用 ?[2-4]。因此世界各國(guó)的研究者對(duì)其在生物防治、促生長(zhǎng)、肥料等方面展開(kāi)了大量的研究工作[5-8]。國(guó)內(nèi)已申 ?請(qǐng)了解淀粉芽孢桿菌的農(nóng)藥登記證 8 張，有效成分含有解淀粉芽孢桿菌的肥料登記證 1000 多張 [9]。利用從鹽堿地植物根際分離得到一株解淀粉芽孢桿菌 S-2，開(kāi)展了培養(yǎng)特性和發(fā)酵條件的優(yōu)化，為S-2 的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌S-2：分離至鹽堿地植物根際土壤，純化后， 斜面保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 5%，蛋白胨 2%， KH2PO40.05%，MnSO40.005%，pH7.0-7.5。

1.3 方法[10-13]

1.3.1 種子制備

從 S-2 試管斜面中挑取菌苔至 LB 搖瓶中（50mL/250mL）， 于 30℃、150rpm 下培養(yǎng) 18h 后，劃線培養(yǎng)，于 30℃培養(yǎng) 24h 后， 取單菌落至LB 搖瓶中30℃、150rpm 下培養(yǎng)18h，得到活化后的S-2， 備用。

1.3.2 鹽度對(duì)菌體生長(zhǎng)影響

以 1.2 中的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，通過(guò)添加 NaCl 來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鹽度，分別配制 NaCl 含量為 0%、1%、2%、4%、5%、6%、7%、8% 的培養(yǎng)基，按照 1.8% 添加瓊脂粉，滅菌后，分別倒培養(yǎng)皿。取 1.3.1 中的種子液，劃線培養(yǎng)，觀察不同鹽度對(duì)生長(zhǎng)的影響。

1.3.3 活菌含量測(cè)定、芽孢含量測(cè)定及芽孢率測(cè)定方法活菌含量測(cè)定方法：稀釋涂平板法[14]

芽孢率含量測(cè)定：

（1）取培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的發(fā)酵液，分裝在 250mL 無(wú)菌三角燒瓶中， 每瓶30mL，6 瓶，備用。恒溫水浴鍋（帶震蕩）設(shè)置溫度（80±1）℃，待溫度穩(wěn)定后，備用。

（2） 上述 6 個(gè)三角燒瓶， 取 3 個(gè)常溫下震蕩 20min， 稀釋涂平板測(cè)定活菌含量。取平均值 VCK。另外 3 個(gè)三角燒瓶，置于80℃的水浴鍋中恒溫震蕩 20min（震蕩頻率與常溫下的對(duì)照相同） 后，立馬取出，自來(lái)水降溫至室溫后，稀釋涂平板檢測(cè)活菌含量。 ?取平均值V 處理。

（3） 芽孢率R=V 處理/VCK×100%

1.3.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

碳源篩選：以 1.2 中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用 5% 葡萄糖、5% 玉米淀粉、6.5% 大米粉代替 5% 蔗糖，其它成分不變，分裝在三角搖瓶中（50mL/250mL），每個(gè)搖瓶接種子液 1mL，30℃、150rpm 下培養(yǎng) 48h 后取樣測(cè)定活菌含量、芽孢率。每個(gè)處理 3 次重復(fù)，取平均值。

氮源篩選：以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)和對(duì)照，分別用酵母粉、 ?花生餅粉、黃豆餅粉、豆粕粉代替蛋白胨。其它條件同上。

1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

考察初始pH（6、6.5、7、7.5、8）和接種量（0.5%、1%、2%） ?對(duì)菌株培養(yǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

不同的微生物對(duì)環(huán)境中鹽含量的耐受度不一樣，可以利用能 耐高鹽含量的微生物在廢水處理、鹽漬化土壤改良等方面。因此考 ?察不同鹽度對(duì)S-2 的生長(zhǎng)影響，結(jié)果見(jiàn)表 1。

表 1 結(jié)果表明，S-2 能夠在NaCl 含量不高于 5% 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， 當(dāng)NaCl 含量為 6% 時(shí)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到 96h，也能觀察到菌體長(zhǎng)出。而 7% 和 8% 的NaCl 平板上，即使延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到 120h，也無(wú)菌 ? 體長(zhǎng)出。由此可知S-2 耐鹽度高，可以在鹽堿地的作物上應(yīng)用。

2.2 不同碳源對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響

不同碳源對(duì)S-2 的培養(yǎng)影響結(jié)果見(jiàn)圖 1。由該結(jié)果可知，不同的碳源對(duì) S-2 的培養(yǎng)結(jié)果有一定的影響。以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基，接種后，菌體生長(zhǎng)迅速，在 36h 時(shí)活菌含量達(dá)到最高，然后開(kāi) 20始進(jìn)入衰退期。由于葡萄糖作為速效碳源，所以消耗速度快，芽孢在 ? 24h ? 時(shí)就開(kāi)始形成，但在芽孢大量形成時(shí)，其活菌含量下降明顯。 ? ? 18綜合考慮活菌含量、芽孢率、成本，選擇大米粉作為S-2 的碳源。

2.3 不同氮源對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響

以大米粉作為碳源，考察不同氮源對(duì) S-2 培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)如下圖 2。

由該表數(shù)據(jù)可知，酵母粉、花生餅粉、黃豆餅粉、豆粕粉的 添加有利于芽孢生成時(shí)間提前。接種后，CK（氮源為蛋白胨）和 ? 花生餅粉的菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。而以豆粕粉為氮源，先進(jìn)入 ?遲緩期，再快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在 48h 時(shí)，活菌含量達(dá)到最高為37.7×108cfu/mL，芽孢率為 95.4%。綜合考慮發(fā)酵的活菌含量和芽孢率，選擇豆粕粉作為S-2 培養(yǎng)的合適氮源。

2.4 pH 對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響

微生物對(duì)環(huán)境的 pH 比較敏感，合適的 pH 環(huán)境有利于菌體的快速生長(zhǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)考察了不同的初始 pH 對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。結(jié)果見(jiàn)圖 3。由該數(shù)據(jù)可知，初始pH 在 6.5-7.5 之間，發(fā)酵后期能保持活菌含量和芽孢率維持在一個(gè)比較高的水平。

2.5 接種量對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響

接種量的大小不僅涉及到發(fā)酵規(guī)模放大后生產(chǎn)線的配套建設(shè)， 而且對(duì)活菌的生長(zhǎng)代謝影響較大。考察了 0.5%、1%、2% 的接種量對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)如下圖 4。

由該數(shù)據(jù)可知，3 個(gè)接種梯度下，菌體立即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 并在 12h 時(shí)活菌含量相差不大，培養(yǎng)到 24h 時(shí)，0.5% 和 2% 接種量的進(jìn)入緩慢衰退期，而接種量為 1% 的，還在緩慢上升。2% 接種量最先產(chǎn)生芽孢，在 48h 時(shí)，1% 接種量的芽孢率要高于 2% 的。因此綜合考慮活菌含量和芽孢率，選擇 1% 作為S-2 培養(yǎng)的合適接種量。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的研究越來(lái)越多，特別是在 綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的大背景下，國(guó)家和農(nóng)戶對(duì)環(huán)境友好、安全高效的以微生物為有效成分的農(nóng)藥和肥料需求越來(lái)越強(qiáng)烈。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株對(duì)植物病原細(xì)菌和病原真菌具有明顯抑制作用的細(xì)菌——解淀粉芽孢桿菌（Bacillus ?amyloliquefaciens）S-2。考察了碳、氮、pH、接種量對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。后續(xù)還需進(jìn)一步將發(fā)酵規(guī)模逐級(jí)放大，以驗(yàn)證和完善發(fā)酵工藝，為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2 的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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