Hedgehog信號通路與“腎虛血瘀”骨代謝失常的實驗研究

鄧洋洋 劉明欣 孫鑫 王慶諺 蔣寧 高巳東 王重一 林浩楠 鄭洪新

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，是一種以骨量低、骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病[1]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal-osteoporosis，PMOP)在骨質疏松癥中占有比例最大，其骨折而帶來的致死、致殘率極高，是亟待解決的重要問題。Hedgehog信號通路對骨代謝具有重要的調節作用，近年來其在骨生物學中的作用受到更多的關注。本研究以Hedgehog信號通路PTCH1和Gli3為切入點，旨在觀察補腎填精中藥復方左歸丸、活血化瘀中藥復方身痛逐瘀湯對PMOP模型大鼠的療效影響，為臨床防治PMOP以及骨重建失常引起的其他慢性疾病提供最佳的中醫藥治療方案，并為其作用機制提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SD大鼠，雌性，3～4月齡，50只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001[2-3]。

1.1.2實驗藥品：補腎填精中藥復方：左歸丸(購于遼寧中醫藥大學附屬第一醫院)；活血化瘀中藥復方：身痛逐瘀湯(購于遼寧中醫藥大學附屬第一醫院)；陽性對照藥：骨疏康顆粒。

1.1.3主要試劑和儀器：ELISA試劑盒(美國R&D systems公司)、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Erase(Takara公司)、Brilliant III Ultra-Fast SYBR? Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies公司)等。雙能 X 線骨密度分析儀(美國 Lunar公司)、Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀(德國安捷倫)、PROTEANTMⅡ聚丙烯凝膠電泳(美國LTI)、凝膠成像分析系統(上海天能)、XE380超低溫冰箱(法國)、3111二氧化碳培養箱(美國)、IX71FL倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)、KOHTRON高速低溫離心機(瑞典)、DU640核酸蛋白分析儀(美國)、Bio-Rad550型酶標儀(美國)、PCS-SP2激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)、ALP30R50液氮生物容器(中國精騏)等。

1.2 方法

1.2.1實驗動物模型建立和分組：采用一次性手術摘除大鼠雙側卵巢造模方法[注：去卵巢大鼠是世界衛生組織(WHO)推薦的研究絕經后骨質疏松癥模型]。術后3 d，進行實驗分組。按體重分層后按照隨機數字表隨機分為補腎填精組、活血化瘀組、陽性對照組、模型空白組及正常組。

1.2.2實驗給藥劑量和方法：給藥劑量：大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計算，給藥容積為1 ml/100 g體重。給藥方法：補腎填精組給予左歸丸，活血化瘀組給予身痛逐瘀湯，陽性對照組給予骨疏康顆粒，模型空白組和正常組給予等體積的生理鹽水。每日灌胃1次。每周稱重1次，根據體重變化重新計算給藥劑量，共灌胃12周。最后一次灌胃禁食24 h后取材。

1.2.3標本采集與檢測

1.2.3.1骨密度：取各組大鼠左側股骨，剔除肌肉，生理鹽水沖洗，紗布包好后封存，應用雙能X線骨密度分析儀檢測[2-3]。

1.2.3.2骨組織和腎組織PTCH1和Gli3蛋白含量測定：取出右側股骨和左腎后，一部分用錫紙包好，具體檢測步驟按ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.3.3骨組織和腎組織PTCH1和Gli3mRNA表達測定：取出右側股骨和左腎后，一部分放入有Trizol液的EP管，使用Primer-BLAST設計引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計分析

2 結果

2.1 骨密度結果

各組間比較，模型空白組比正常組骨密度降低，具有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功。補腎填精組、陽性藥物對照組比模型空白組的骨密度提高，具有顯著性差異(P<0.01)，活血化瘀組比模型空白組的骨密度提高，具有統計學意義(P<0.05)。提示補腎填精、活血化瘀中藥復方可以提高大鼠去勢后骨密度，糾正骨代謝失常，其中補腎填精中藥復方優于活血化瘀中藥復方[2-3]。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度檢測結果比較

2.2 各組大鼠骨組織中PTCH1mRNA及其蛋白表達

各組大鼠骨組織中PTCH1mRNA相對表達量方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調PTCH1 mRNA相對表達量優于活血化瘀組和陽性藥物對照組。各組大鼠骨組織中PTCH1蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調PTCH1 蛋白含量優于活血化瘀組。見表3。

表3 大鼠股骨中PTCH1mRNA相對表達量和PTCH1蛋白含量結果

2.3 各組大鼠腎組織中PTCH1mRNA及其蛋白表達

各組大鼠腎組織中PTCH1mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調PTCH1 mRNA相對表達量優于活血化瘀組。各組大鼠腎組織中PTCH1蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，補腎填精組比陽性對照組顯著降低(P<0.01)，補腎填精組比陽性對照組顯著升高(P<0.01)，提示補腎填精組下調蛋白含量優于活血化瘀組和陽性藥物對照組，但沒有陽性藥物對照組下調得好。見表4。

表4 大鼠腎組織PTCH1mRNA相對表達量和PTCH1蛋白含量結果

2.4 各組大鼠骨組織中Gli3mRNA及其蛋白表達

各組大鼠骨組織中Gli3mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組大鼠比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組降低(P<0.05)、補腎填精組比陽性對照組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調Gli3mRNA相對表達量優于活血化瘀組和陽性藥物對照組。各組大鼠骨組織中Gli3蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組降低(P<0.05)，提示補腎填精組下調Gli3蛋白含量優于活血化瘀組；補腎填精組比陽性對照組顯著上升(P<0.01)，提示陽性對照組下調Gli3蛋白含量優于補腎填精組。見表5。

表5 大鼠股骨中Gli3mRNA相對表達量和Gli3蛋白含量結果

2.5 各組大鼠腎組織中Gli3mRNA及其蛋白表達

各組大鼠腎組織中Gli3mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調Gli3mRNA相對表達量優于活血化瘀組。各組大鼠腎組織中Gli3蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補腎填精組下調Gli3蛋白含量優于活血化瘀組；陽性對照組比補腎填精組顯著下降(P<0.01)，提示陽性對照組下調Gli3蛋白含量優于補腎填精組。見表6。

表6 大鼠腎組織中Gli3mRNA相對表達量和Gli3蛋白含量結果

3 討論

3.1 PMOP的中醫病因病機

中醫“腎藏精主骨”理論是藏象學說的重要組成部分，從“腎主骨”理論防治骨代謝失常的疾病特別是骨質疏松癥,在臨床上具有特色和優勢。“腎主骨”理論最早見于《黃帝內經》諸多篇章，如《素問·宣明五氣》曰：“腎主骨”。在《素問·上古天真論》這一篇，將女子以七為序，男子以八為序，分別論述了腎中精氣從稚嫩到充盛繼而衰減，人的外在形體的齒、發、骨有著相應的變化。可見，人體的骨骼得到充足的腎精滋養才能正常的發育生長，維持堅實的狀態。當腎藏精失職，腎精氣虧虛，骨失所養，便形成骨質疏松癥。

由于絕經后女性往往臟腑生理功能衰退，影響精、氣、血、津液的生成和運行，常常發生氣虛無力行血，導致血液運行遲緩，久而久之形成瘀血，使血脈、經絡不通，不通則痛，骨骼產生疼痛的癥狀。孫益等[4]通過臨床流行病學調查發現，瘀血質占絕經后骨質疏松癥的11%，且臨床癥狀上患者出現腰背部明顯的刺痛、固定不移、動則加重、舌暗有瘀斑、脈細澀等表現。所以針對上述PMOP的中醫病因病機，本次研究采用補腎填精、活血化瘀法進行干預治療，并且比較兩種不同治療方法的療效。臨床上中藥骨疏康顆粒具有補腎益氣，活血壯骨的功效，主治腎虛、氣血不足所致的中老年骨質疏松癥，伴有腰脊酸痛、足膝酸軟、神疲乏力等癥狀。臨床應用十余年，療效肯定，所以本次研究選取中藥骨疏康顆粒作為陽性藥物對照組。

研究結果提示，補腎填精、活血化瘀中藥復方、陽性藥物對照組均可以提升大鼠股骨骨密度，其中補腎填精組和陽性藥物對照組在提高骨密度方面，與模型組比較具有顯著性差異。活血化瘀組在提高骨密度方面與模型組比較差異，具有統計學意義。從骨密度數值來看，補腎填精組高于活血化瘀組，但補腎填精、活血化瘀組之間比較差異并無統計學意義。說明兩種中藥復方都能夠促進骨骼修復，對PMOP的骨代謝失衡起到調節作用，從而起到防治作用。

3.2 Hedgehog信號與骨質疏松癥的關系

3.2.1Hedgehog信號與骨代謝：Hedgehog( hedgehog，HH) 信號通路對骨代謝具有重要的調節作用，近年來其在骨生物學中的作用受到更多的關注。HH信號通路對骨形成及MSCs 成骨分化進行調控[5]。Hedgehog蛋白家族主要包括3種同源蛋白質，分別是Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)。本研究團隊在前期工作的基礎上圍繞Hedgehog信號通路開展了探討PMOP骨代謝失常的分子機制研究。研究發現，去卵巢骨質疏松癥模型大鼠Hedgehog信號通路中蛋白家族SHH、Gli1異常表達，可能是導致骨質疏松癥發病的機制之一[2-3]。

3.2.2PTCH1、Gli3與骨代謝：Hedgehog信號通路發生作用的過程中，Hedgehog信號分子可與細胞表面受體PTCH1結合，使靶基因平滑受體Smo活化，活化的Smo與類運動蛋白Cos2等結合形成復合物，該復合物可激活Hedgehog信號通路中鋅指蛋白家族Glis，促使Glis進入核內聚集并激活轉錄，進而啟動下游靶基因的表達[5]。PTCH1是Hedgehog信號通路中一個關鍵的結合點[6]。PTCH1究竟在PMOP發病機制中扮演何種角色，是否因為PTCH1的異常改變導致Hedgehog信號通路被激活而引起骨代謝異常，將是本次實驗繼續關注的內容，即試探討PMOP的發病機制與PTCH1和Gli3的關系。

4 小結

本研究結果表明，正常組大鼠骨、腎組織中可以表達PTCH1和Gli3mRNA及其蛋白。與正常組比較，模型組大鼠骨組織和腎組織中PTCH1和Gli3mRNA表達及其蛋白含量顯著升高；與模型空白組比較，各個用藥組均能使PTCH1和Gli3mRNA表達及其蛋白含量顯著下調；各個用藥組間比較，補腎填精組PTCH1和Gli3mRNA表達及其蛋白含量下調優于活血化瘀組，有顯著性差異。研究結果提示，PTCH1mRNA及蛋白含量和Gli3mRNA及蛋白含量在去卵巢骨質疏松癥模型大鼠骨組織和腎組織中顯著升高，提示PTCH1和Gli3可能參與絕經后骨質疏松癥骨代謝失衡的發生和進展。補腎填精中藥復方和活血化瘀中藥復方可下調PTCH1和Gli3mRNA相對表達量及其蛋白含量，這可能是起到防治絕經后骨質疏松癥的作用機制之一。