銅和強力霉素復合污染對土壤微生物與酶活性的影響*

陳欣瑤，肖祖飛，祝妍華，武 劍，華倩雯，張 園?

（1.蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇蘇州 215009；2.蘇州工業園區環境監測站，江蘇蘇州 215027；3.蘇州高新區環境監測大隊，江蘇蘇州 215000）

農業土壤污染已成為當前亟待解決的問題之一，多種污染物在土壤共存并互相作用促使土壤污染趨于多樣化和復雜化，導致復合污染逐漸成為土壤污染的研究重點[1-2]。其中重金屬（包括Cu、Zn）和抗生素常被廣泛應用為飼料添加劑[3-6]，但二者的施用可能導致特定微生物對其敏感性降低，減少畜禽對其他抗菌藥物的易感性[4，6-7]。糞便改良農田可能具有加快土壤中抗生素和重金屬共存積累和刺激土壤菌群抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）傳播轉移的風險[2，7-10]，使土壤成為重金屬、抗生素和ARGs的重要儲存庫之一，進而增加農作物和蔬菜的潛在健康風險[9-12]。此外，土壤生物活動主要由生態系統最重要組分之一的微生物來控制，從而導致微生物活性、多樣性、群落結構和酶活性等常被建議作為土壤生態系統功能的評價指標[1，6，13-15]。

相關研究表明，重金屬污染會明顯影響土壤微生物、酶的活性，且不同類型、濃度重金屬對土壤微生物多種功能的影響效果也會顯現出較大差異性[16-17]。低濃度抗生素能促進土壤微生物呼吸，而環境濃度抗生素則不會顯著影響微生物呼吸[18-19]。抗生素與重金屬的絡合、交互可能會對土壤微生物造成更大的毒性影響[4，9，11]。劉愛菊等[20]發現磺胺甲基嘧啶與 Cu低劑量復合可能誘導土壤微生物對二者產生交互抗性，而高劑量復合污染則可能顯著性地協同抑制土壤微生物生態功能。此外，環境中抗生素和重金屬的釋放均能夠促進ARGs豐度增加；重金屬與抗生素耐藥性的傳播間存在一定的聯系[20-22]。Knapp等[21]對蘇格蘭土壤分析表明，土壤 Cu濃度與tetM/W、blaOXA、ermB/F豐度有顯著性相關關系。Cheng等[22]發現種植蔬菜、黑麥草土壤中tetARGs豐度與四環素類抗生素濃度顯著相關。

目前，國內外針對抗生素與重金屬復合污染的研究所選取的抗生素類型多是青霉素、四環素、土霉素等，對強力霉素（Doxycycline，DOX）的研究還比較少[23-25]。DOX 作為獸藥因在抗菌效果、口服生物利用度等方面明顯優于傳統四環素類抗生素，與 Cu一樣被廣泛應用于畜牧養殖業，導致其隨畜禽糞便代謝的產物與殘留在糞肥改良周圍土壤中大量累積[26]。因此，研究DOX和Cu復合污染對土壤微生物呼吸、酶（脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶）活性、ARGs（tetA/C/G/M/W/X）豐度等土壤生態指標的影響，以期為土壤重金屬和抗生素復合污染的生態風險評估和微生物預警體系建立等工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣品為南京農業大學（32°01'46″N，118°50'22″E）采集的非農用裸土，隨機選擇三個間隔10 m的地塊（范圍0.5 m×0.5 m），去除1 cm表層土，收集1～20 cm土壤，風干研磨過2 mm篩備用[14-15]。土壤 Cu 背景值為 47.71 mg·kg–1，pH 為5.48±0.23，總有機碳為 18.61±0.57 mg·kg–1，全氮為1.19±0.21 mg·kg–1，碳氮比為 21.48±0.42，CEC 為23.12±0.74 mol·kg–1。pH 采用 PHS-3E 測定，土水比1︰5（w/v）；全碳、全氮采用元素分析儀測定；CEC采用乙酸銨交換法測定[14-15，27]。

1.2 實驗設計

土壤樣品分為三部分，加入并充分混合氯化銅溶液，使土壤中添加的 Cu分別為 0、100和400 mg·kg–1（以下記作 Cu0、Cu100 及 Cu400），土壤含水量調整為18%，然后在25℃下活化48 h。將三個上述Cu處理的土壤分為三部分，加入DOX溶液（98%美國藥典級）使其濃度分別為 0、8和15 mg·kg–1（以下記作 DOX0、DOX8 及 DOX15），調整含水量至 25%[15，27]。將處理后土壤樣品放入寬口塑料瓶中，纖維膜密封，確保通風，減少水分蒸發，期間保持25℃和25%含水率恒溫恒濕培養[14-15，27]。分別在培養 1、3、7、15、22、30 d分析土壤微生物指標，不添加外源污染物的土壤定義為 CK空白對照，處理方式及其標記見表1。

表1 外源污染物的添加濃度與處理組的標記方式Table 1 Concentration of exogenous pollutants added and labeling of the treatments

1.3 微生物呼吸分析

本研究采用底物誘導呼吸速率實驗進行土壤樣品培養。在培養 1、3、7、15、22、30 d從各處理組分別稱取 12 g土樣于塑料瓶中，加入葡萄糖（30 mg·g–1土樣）與土壤充分混合以促進微生物呼吸，隨后放置裝有5 mL 0.2 mol·L–1NaOH的玻璃瓶于塑料瓶中并密封，在28°C恒溫培養12 h，呼吸剩余 NaOH 加入 1.0 mol·L–1BaCl2溶液后，用0.05 mol·L–1HCl 溶液進行滴定[14-15，27-28]。分別對各取樣點土壤進行底物誘導呼吸速率實驗，每次實驗設置無土壤空白對照，每組3個重復。微生物呼吸強度（mg·12h–1）的計算公式表示為：

式中，V為HCl溶液的滴定值（L）；C為鹽酸溶液的摩爾濃度（mol·L–1）；n為 NaOH 吸收溶液相對HCl滴定溶液的濃度倍數，取值4；M為CO2分子質量（mg·mol–1）；t為底物誘導微生物呼吸實驗的培養時間，12 h。

1.4 土壤酶活性分析

通過 3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性，以通過每克干土24 h內產生的葡萄糖（mg）的量來表示[28-30]。通過苯酚鈉比色法測定脲酶活性，表示為每克土壤24 h后殘留NH3-N的質量（mg）[29]。通過高錳酸鉀滴定檢測過氧化氫酶活性，表示為每克干土1 h內小消耗KMnO4體積（mL）[30]。

1.5 DNA提取和定量實時PCR（qPCR）分析

對培養 1、7、15、30 d的土壤樣品提取 DNA進行ARGs及微生物群落結構的測定。取約0.5 g土壤樣品，根據 FastDNA?Spin Kit（MP Biomedical，Santa Ana，California，USA）提供的實驗操作流程提取土壤微生物DNA。提取的DNA用1% 的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測提取效果。并用紫外分光光度計ND-1000（Nano-Drop，美國）測定所提取DNA濃度及純度[7，31-32]。提取所得到的有效DNA儲存于–20℃冰箱，以備后續實驗使用。

本次研究ARGs的測序采樣HT-qPCR，選用7對引物，包含 6對 ARGs引物（tetA/C[33]、tetG/M/W/X[26]）和1對16S rRNA gene引物（515F和907R）[32]。本實驗采用 SmartChip Real-time PCR Systems（WaferGen，美國）高通量熒光定量的反應平臺。PCR定量體系為100 nL（1×LightCycler 480 SYBR Green I Master、1 mg·mL–1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、500 nmol·L–1引物以及 5 ng·μL–1DNA 樣品）。混合好的 PCR 體系由SmartChip 納米分配器分加到一個待用的SmartChip中，將密封SmartChip裝到SmartChip 循環儀中運行。ARGs定量PCR反應程序為：94℃預變性10 min；94℃變性40 s，退火溫度對應上述順序分別為 58、54、68、55、64及 57℃延伸 30 s，40個循環，72℃再延伸 10 min，4℃保存[26]。16S rRNA gene定量PCR反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 20 s（40 個循環）；72℃ 4 min；4℃保存[7]。程序自動升溫進行熔解曲線分析根據SmartChip Real-Time System的檢測限和靈敏度。

將同一樣本的PCR擴增的產物混合后用2% 瓊脂糖凝膠做電泳檢測，使用 DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）切膠回收 PCR擴增得到的產物，洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。提取的質粒用紫外分光光度計測定濃度后，按10倍濃度梯度稀釋系列（拷貝數從n×1010系列稀釋至n×102），以拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線。標準質粒拷貝數（C1）計算公式如下：

耐藥基因拷貝數（copies·g–1）的方法如下：

式中，C1為標曲計算所得基因拷貝數（copies·μL–1）；L為阿弗加德羅常數（6.02×1023）；C為質粒 DNA濃度（ng·μL–1）；N為目標基因的模板長度（bp）；M為每對DNA的平均分子量 660；M1為土壤干重（g）；V為洗脫DNA體積（μL）。

1.6 數據處理

本研究數據統計結果用平均數±標準誤（M±SE）表示，運用Excel 2016及SPSS 24.0進行數據分析，影響率=（處理組–CK）/CK×100%。采用方差分析（One-way ANOVA with LSD 多重方差分析，Kruskal-Wallis test）進行差異顯著性分析，采用Pearson系數進行相關性分析，顯著水平P值設為0.05，極顯著水平P值設為0.01。運用Origin 2017進行圖像處理。

2 結 果

2.1 銅和強力霉素污染對土壤微生物呼吸的影響

本研究通過室內培養實驗測定 DOX、Cu單一及復合脅迫下土壤微生物呼吸強度，以此定量表征微生物活性。土壤微生物呼吸強度波動范圍為0.61～16.21 mg·kg–1（圖1）。研究結果表明不同濃度DOX與Cu單一及復合污染在培養期內均會顯著抑制土壤微生物呼吸強度（P<0.05），且對微生物呼吸的抑制作用均在培養15/22 d最弱。此外，對于同一污染類型，微生物在培養初期（1 d）的呼吸強度均大于其在培養終期（30 d）的呼吸強度。

DOX單一污染在培養期會始終抑制對土壤微生物呼吸，抑制率在培養1 d最大。對于Cu單一污染，結果表明Cu400處理下微生物呼吸始終保持在較低水平，而Cu100處理下微生物呼吸強度在培養期內雖均低于CK，但隨培養時間不斷恢復增強。

對于Cu、DOX復合污染（見圖1），DOX8/15（+Cu100）單一/聯合作用時的抑制率均在 1 d達到最大，抑制率范圍為81.47%～95.04%，且抑制強度均隨時間先降低后加劇，DOX存在會加劇 Cu100脅迫對微生物呼吸的抑制，且該抑制作用隨 DOX濃度升高增強。當 DOX8/15+Cu400作用時，其在培養期間對土壤微生物呼吸維持較高的抑制作用，抑制率始終高于45%，且DOX8會加大Cu400對微生物呼吸的抑制作用，而DOX15培養期內一度緩解Cu400的該毒性作用。

2.2 銅和強力霉素污染對土壤酶活性的影響

土壤酶活性常被用來衡量土壤中各種生化反應的動力和強度，是土壤肥力大小的重要標志[33]。土壤酶活性的改變一定程度可用來判斷土壤受污染程度[26]。由上述污染對土壤微生物呼吸的影響可知，培養3 d多為微生物呼吸某一變化趨勢的中間節點，故本研究通過在培養1、7、15、22、30 d測定脲酶、蔗糖酶及過氧化氫酶活性來比較處理間的效果差異。

由圖2可知，DOX單一污染培養期內均能明顯促進土壤脲酶活性，激活率隨時間逐漸升高，但兩者濃度不同造成的激活率差異性不大。Cu100單一作用能促進脲酶活性；而Cu400單一作用對脲酶活性有抑制作用，抑制率在1 d達到最大，但脲酶活性隨時間能夠基本恢復。對于Cu、DOX復合污染，其在 1 d對脲酶活性為弱抑制作用，其中Cu100+DOX8/15與 Cu400+DOX8復合在培養后期對脲酶活性轉化為激活作用，但 Cu400+DOX15處理后期仍表現出抑制作用。故上述類型污染對脲酶活性在培養期（1～30 d）均主要表現為促進作用，除 Cu400+DOX15復合脅迫時在培養期對脲酶活性表現出較強的抑制作用，這可能是因為兩者高濃度疊加所帶來的毒性危害。

DOX、Cu單一及復合污染對土壤蔗糖酶活性的影響見圖2。Cu、DOX單一及復合污染對蔗糖酶在培養期內主要為抑制作用，抑制強度隨時間推移逐漸減弱，30 d基本恢復至初始水平。DOX單一處理對蔗糖酶活性整體呈抑制作用，DOX8對蔗糖酶活性的抑制率隨時間逐漸增大；DOX15前期抑制酶活性，終期（30 d）激活蔗糖酶活性。單一Cu脅迫及其與DOX復合脅迫對蔗糖酶活性均呈現“抑制-激活”趨勢。研究還發現 Cu100+DOX8/15復合作用的修復轉折點是22 d，而Cu400+DOX8/15復合作用修復轉折點提前，為15 d。

培養期內，Cu、DOX單一及復合污染對過氧化氫酶活性主要表現為抑制作用，但該抑制強度要明顯大于蔗糖酶（圖2），抑制強度隨著培養時間逐漸減弱，且30 d基本均恢復至初始水平，即其能在30 d內恢復DOX、Cu單一及復合污染。培養期各處理方式下土壤過氧化氫酶活性的差異性并不顯著，單一 Cu脅迫使過氧化氫酶活性先降低后增加，激活轉折點為7d，且激活強度相對較弱。復合污染處理中，僅Cu400+DOX15在30 d仍保持抑制作用，即DOX與Cu高濃度復合給過氧化氫酶活性帶來不可逆毒性影響。

2.3 銅和強力霉素污染對抗生素抗性基因相對豐度的影響

由于本研究對土壤系統中ARGs豐度的探究更強調 Cu、DOX復合污染添加前后對其的影響差異性，但為確保該差異性的產生具有一定的合理性和過渡性，本研究又在培養前期和中期各增加一個檢測點，即在培養1、7、15、30 d檢測并計算各處理中的6種tetARGs的相對豐度。本研究共檢出tetA、tetC、tetG及tetW 4種ARGs（見圖3）。

圖3表明，DOX、Cu單一及復合污染處理下，tetA相對豐度隨時間基本呈先降低后增加的趨勢，相對豐度最高值出現在培養1 d的CK空白對照組，復合污染在培養7 d、15 d對tetA相對豐度的抑制大于其余污染組。復合污染處理下，tetW 相對豐度隨時間先增加后降低，且該基因相對豐度的整體水平偏低于其他基因。此外，研究發現 Cu400+DOX15在培養15 d其tetA、tetW相對豐度上升約2個數量級，上升幅度遠高于該時間點其余處理組。

對于檢出的4種ARGs的總相對豐度（圖4），除 DOX8與 Cu100外，其余處理隨培養時間的變化趨勢為“降低-升高”，且ARGs總相對豐度在培養1 d的水平基本均高于其在培養30 d的水平，僅Cu400+DOX15復合在培養30 d的ARGs總相對豐度略高于1 d；而對DOX8、Cu100兩種單一污染，ARGs總相對豐度隨時間的變化趨勢為“升高-降低-升高”。上述現象說明 Cu、DOX 單一及復合污染在培養中-后期均有一定的可能性會提高該tetARGs的總相對豐度。所有處理中，Cu400+DOX15復合污染處理能在培養15 d、30 d顯著提高ARGs的總豐度，且該豐度水平遠高于其余處理。此外，研究發現tetA豐度對檢出ARGs總相對豐度的貢獻率遠大于其他ARGs（圖3，圖4）。

3 討 論

3.1 銅和強力霉素對土壤微生物呼吸的作用

目前，DOX和Cu廣泛應用于治療各種感染病導致其在畜禽糞便大量累積，且隨著畜禽糞便作為有機肥料施用轉移至農業土壤[20，26]。本研究中，強力霉素和銅單一和復合污染在培養期內均會顯著抑制土壤微生物呼吸（P<0.05）（圖1），其對微生物呼吸的抑制作用均在培養15/22 d表現最弱，且對于同一污染類型，微生物在培養末期的呼吸強度大于初期，這可能是土壤微生物在接受外源污染物時需要15 d以上的時間才能逐步適應變化并削弱污染物的負面影響，以在培養后期維持土壤生態系統的功能穩定[14-15]。

研究發現，相對于單一污染，復合污染在培養期間對微生物呼吸具有更強的抑制作用，且Cu400+DOX8/15復合污染對土壤微生物呼吸的抑制強度大于 Cu100+DOX8/15（圖1），這與前人的相關研究結果類似[8，19，34]。這可能是由于復合污染條件下DOX能通過官能團與Cu2+發生絡合反應，導致Cu、DOX與其形成的絡合物能加大對土壤微生物的毒性作用，促使微生物的數量隨著Cu100/400的添加而降低，降低幅度隨Cu濃度增加而增大。另有相關研究表明土霉素、恩諾沙星、磺胺嘧啶與Cu復合能明顯抑制細菌、真菌和放線菌的數量，且微生物數量隨著Cu濃度增加逐漸減少，能有效支撐上述研究結果[24]。此外，Cu400+DOX8復合污染對土壤培養期間總微生物呼吸的抑制效應大于Cu400+DOX15，這可能是由于Cu400和DOX15的高濃度疊加會使微生物積極維持甚至刺激其呼吸作用，從而抵御高毒性或高濃度外源污染物的復合污染[23，35]。

3.2 銅和強力霉素對土壤酶活性的作用

本研究發現，Cu、DOX單一污染在培養期內對脲酶活性主要為促進作用，Cu添加濃度與脲酶活性極顯著正相關（P<0.01）。李曉陽[26]施用含DOX糞肥改良土壤發現DOX能促進脲酶活性增高，孟慶峰等[28]發現低濃度 Cd、Pb對脲酶活性有促進作用，一定程度能支持上述結果。Cu、DOX單一污染對蔗糖酶、過氧化氫酶活性主要為抑制作用，抑制作用隨時間減弱甚至轉為激活作用，Cu添加濃度與過氧化氫酶、蔗糖酶活性均顯著負相關（P<0.05，P<0.01）。這與閆雷等[23]發現土壤培養實驗中Cd對蔗糖酶活性的抑制率隨時間先增大后減小，且Cu、Cd、Zn及Pb對蔗糖酶、過氧化氫酶活性多表現為抑制作用的結果相似[36-37]。此外，有研究發現 OTC、SNR、SM2及ENR等抗生素單一污染對蔗糖酶、過氧化氫酶活性均表現出抑制作用[36，38]，支持了本研究DOX污染能抑制蔗糖酶、過氧化氫酶活性的結論。

整體而言，復合污染物對于土壤酶活性的污染效應較單一污染物高（圖2），這可能與DOX能通過官能團與Cu2+發生絡合反應，互相影響并改變其存在形態，從而使 DOX、Cu復合時能對土壤酶活性產生協同促進/抑制作用[36]。研究發現 Cu、DOX復合污染對脲酶活性多表現為先抑制后促進，但Cu400+DOX15復合脅迫對脲酶活性始終表現出強抑制作用，這可能是因為兩者高濃度疊加會降低土壤脲酶專性微生物的數量、有機質含量等，導致脲酶難以修復該污染毒性。Cu、DOX復合污染對蔗糖酶、過氧化氫酶活性表現出抑制作用，這與前人通過土壤培養發現土霉素與Cd復合污染以及OTC、SNR、SM2與 Cu復合污染對蔗糖酶、過氧化氫酶活性均表現出抑制作用，且抑制強度相較于抗生素單一污染更大的研究結果類似[23，36]。但DOX和Cu對土壤酶活性的復合污染效應，不管是協同作用還是拮抗作用，都并非各單一污染物毒性作用的加和，而是在各污染物間存在著復雜的交互作用，因此復合污染產生的抑制作用強弱還應與二者的交互作用類型有關，具體的影響機制有待進一步的研究。

3.3 銅和強力霉素污染條件下土壤微生物對污染物的適應性

本研究發現，土壤微生物在應對 DOX、Cu單一與復合外源脅迫時可能需要7～15 d的老化適應才能增強土壤微生物誘導產生抗性的能力，促使 4種檢出 ARGs總相對豐度整體呈先降低后升高的趨勢（圖4）。此外，研究中tetARGs總豐度最高值出現在CK-1d（圖4），這可能是因為培養初期DOX與Cu的添加帶來的環境選擇壓力會使土壤微生物的數量和結構發生變化，使抗性基因的潛在宿主減少[39]，從而導致污染處理組ARGs的豐度在培養初期出現短暫降低。

在復合污染中，Cu400+DOX15復合對tetARGs豐度的影響遠大于其余處理（圖4），高濃度Cu的添加在培養中后期具有增強 DOX誘導產生 ARGs以提高其相對豐度的潛在能力，這可能是由于重金屬在培養中后期適應環境后，可以促進金屬和抗生素之間的金屬橋接功能，使其能以存在共選擇作用等方式降低外源抗生素的選擇壓力和豐度，并刺激ARG 的增加[9，40]。de la Iglesia 等[41]研究發現 As、Cu等重金屬和抗生素的復合污染可以增加環境中ARGs的豐度。張佳奇等[35]總結發現重金屬污染地區的ARGs豐度隨著重金屬污染水平增加而增加。Wang等[42]類似研究表明恩諾沙星和Cd復合污染對氨氧化細菌amoA基因數的抑制率明顯存在時間—效應關系，且復合污染具有更高的抑制率。Lin等[43]表明施肥土壤中 ARGs豐度上升可能與 Cu、Zn的積累密切相關。以上研究均有效支撐本文上述結果。

研究還發現，tetA和另三種tet基因（tetC、tetG和tetW）的相對豐度存在顯著正相關關系（P<0.05），表明tetA豐度變化在一定程度上可以表征其余三種抗性因的變化趨勢。tetC豐度和tetW豐度、tetG豐度和tetARGs總豐度存在極顯著強正相關關系（P<0.01），其相關系數分別為0.985和0.999，表明上述兩兩基因類型在某種程度上可以互相表達其豐度水平，但這些基因之間是否存在確切的指代關系仍需更多的研究來證明。

4 結 論

土壤培養條件下，Cu與DOX單一及復合污染會顯著抑制土壤微生物呼吸（P<0.05），其對脲酶活性主要為促進作用，對蔗糖酶、過氧化氫酶活性主要表現為抑制作用。相對于單一污染，復合污染對土壤微生物呼吸、酶活性及抗性基因豐度的影響程度更明顯，其中Cu400+DOX8復合對酶活性的影響程度更為明顯。此外，外源 DOX、Cu添加帶來的環境變化在培養初期會使土壤微生物數量和結構發生變化，使抗性基因的潛在宿主減少，從而導致培養初期抗性基因豐度會出現短暫降低，且添加高濃度Cu會潛在提高DOX在培養終期誘導產生ARGs的能力水平，提高tet基因的相對豐度。