甘露子提取物的不同提取方法及其體外抗氧化活性研究

劉洪巖 王巍 劉曉敏

摘 要：為探究甘露子提取物的體外抗氧化活性，本文將甘露子提取物用水提煎煮法、回流醇提法及超聲醇提法進(jìn)行提取，然后采用薄層色譜法對(duì)水提物中糖類化合物進(jìn)行定性檢測(cè)，黃酮類化合物通過(guò)其顏色反應(yīng)專屬性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定性檢測(cè)，采用DPPH和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)對(duì)提取物進(jìn)行體外抗氧化活性研究。結(jié)果表明，甘露子水提物和醇提物都具有體外抗氧化活性，其中超聲醇提法提取物的體外抗氧化活性優(yōu)于回流醇提法、煎煮水提法。由于甘露子具有藥食同源性，本研究可為后續(xù)食品、保健品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘露子;提取方法;體外抗氧化活性

甘露子是唇形科植物甘露子的塊莖，又叫草石蠶、地蠶、土人參。主要分布于長(zhǎng)江附近各省，其具有祛風(fēng)清熱、利水、活血化瘀等功效，用于治療風(fēng)熱感冒，黃疸等癥狀，外用可治療毒蛇咬傷。甘露子的主要化學(xué)成分為糖類、黃酮類化合物，有良好的抗腫瘤、抗炎、抗疲勞，提高免疫力等藥理作用。

黃酮類化合物具有多種生物活性功能，其中抗氧化作用尤為明顯。甘露子中含糖量豐富（鮮品中水蘇糖含量在13%左右），水蘇糖是一種低聚四糖、穩(wěn)定、甜度低、熱量低，具有促進(jìn)腸道菌群平衡生理功效[1-2]。由于國(guó)內(nèi)對(duì)甘露子提取物的抗氧化活性研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)煎煮水提法提取糖類化合物，回流醇提法、超聲醇提法提取黃酮類化合物，糖類化合物通過(guò)薄層層析法進(jìn)行定性檢測(cè)，黃酮類化合物通過(guò)其顏色反應(yīng)專屬性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定性檢測(cè)。3種提取方法的甘露子提取物通過(guò)ABTS和DPPH·清除率實(shí)驗(yàn)兩種方法進(jìn)行體外抗氧化活性研究，確定甘露子提取物中水蘇糖和黃酮類化合物的體外抗氧化活性。隨著生活水平的提高，具有抗氧化活性等保健功效的食品藥品備受關(guān)注。為此，本文旨在對(duì)甘露子提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以更好地開(kāi)發(fā)利用甘露子[3]。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮甘露子：挑選去除雜質(zhì)，搶水洗，淋干備用。

無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、維生素C、二苯基-2-三硝基苯肼、2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、鎂粉、濃鹽酸、乙醇、三氯化鐵、濃硫酸、乙酸乙醋、甲醇、冰醋酸、二苯胺、苯胺、丙酮、85%磷酸、葡萄糖對(duì)照品、蔗糖對(duì)照品、棉籽糖對(duì)照品、水蘇糖對(duì)照品、均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

2 000 W電爐子（北京光明）、BHS-8220A型干燥箱（上海科技）、TZ-120S6型超聲波清洗器（方奧微電子）、ZE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（山海雅榮）、DAA428S型電子天平（賽多利斯）、W3新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析）、PTZ-9C型酸度計(jì)（上海科技）、200～1 000 μL型移液器（大龍興創(chuàng)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘露子提取物的提取

①水提煎煮法。取新鮮甘露子0.5 kg，加4 000 mL水提煎煮3次，每次1 h，合并醇提液，濃縮至每1 g甘露子提取物中含有10 g主藥。②回流醇提法。取鮮甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶劑，醇提液濃縮至每1 g甘露子提取物中含有10 g主藥。③超聲醇提法。取鮮甘露子0.5 kg，加90%乙醇800 mL超聲提取3次，每次1 h，回收溶劑，濃縮至每1 g甘露子提取物中含有10 g主藥。

1.3.2 甘露子提取物中糖類化合物和黃酮類化合物的定性檢測(cè)

（1）薄層層析法定性檢測(cè)甘露子提取物中糖類化合物。①配制對(duì)照液。精密稱量葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖對(duì)照品，分別加純化水溶解，配制成濃度為5 mg/mL的對(duì)照液。②配制供試液。甘露子提取物分別稀釋成5 mg/mL的供試品。③配制顯色劑。取5 mLH3PO4、25 mL丙酮、0.5 g

二苯胺、0.5 g苯胺混合搖勻。④點(diǎn)樣。各取20 ?L對(duì)照液和供試品點(diǎn)在硅膠G板上。⑤展開(kāi)。以乙酸乙醋-MaOH-水-HAc（3∶2∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以顯色劑在薄層上，于105 ℃烘箱內(nèi)加熱至斑點(diǎn)顯現(xiàn)，取出在日光下檢視[4]。

（2）甘露子提取物中黃酮類化合物定性檢測(cè)。①供試液的制備。3種提取方法下提取液1 mL，分別加10 mL乙醇，搖勻，備用。②HCl-Mg反應(yīng)。量取供試液0.5 mL，1 mLMeOH，在加0.1 gMg充分進(jìn)行振搖，加入3滴HCl，搖勻。③絡(luò)合反應(yīng)。取供試液0.5 mL，1 mLMeOH，加入1%FeCl32滴，搖勻。④濃H2SO4反應(yīng)。量取供試液0.5 mL，1 mLMeOH，加濃H2SO4 2滴，搖勻。⑤強(qiáng)堿溶液反應(yīng)。取供試液0.5 mL，1 mLMeOH，加4%的NaOH溶液1 mL，搖勻[5]。

1.3.3 甘露子提取物體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

供試液配制：精密量取各方法下甘露子提取物，分別加MeOH配制成100 mg/mL的樣品溶液，然后稀釋成1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL和40 mg/mL的樣品溶液。

（1）DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。①配制DPPH反應(yīng)液。取3.0 mgDPPH，60 mL MeOH，超聲5 min溶解，避光放置備用。②空白吸光度測(cè)量。取2 mL DPPH反應(yīng)液于比色皿中，加1 mL MeOH搖勻，在519 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸收光度值A(chǔ)0。③供試品吸光度測(cè)量。取2 mL DPPH反應(yīng)液于比色皿中，加1 mL供試液搖勻，避光0.5 h，在519 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸收光度值A(chǔ)，測(cè)量3次平行實(shí)驗(yàn)。ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[6]。

（2）ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)。①配制ABTS原液。取

0.012 2 g ABTS，用3 mL純化水溶解，搖勻。②配制K2S2O8原液。稱取0.003 g K2S2O8，加4.3 mL純化水溶解，搖勻。③配制ABTS反應(yīng)液。取上述兩種原液各3 mL混合均勻，避光反應(yīng)12 h，用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋10倍，避光備用。④空白吸光度測(cè)量。取2.4 mLABTS反應(yīng)液加入比色皿中，加0.6 mLMeOH搖勻，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸收光度值A(chǔ)0。⑤供試品吸光度測(cè)量。取2.4 mLABTS反應(yīng)液加入比色皿中，加0.6 mL供試液搖勻，避光0.5 h，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸收光度值A(chǔ)，測(cè)量3次平行實(shí)驗(yàn)。⑥ROS清除率（%）=（A0-A）/A0×100%[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露子提取物的提取

實(shí)驗(yàn)通過(guò)煎煮水提、回流醇提、超聲醇提得到甘露子提取物，各提取方法的提取物密度見(jiàn)表1。

2.2 甘露子提取物中糖類化合物和黃酮類化合物的定性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)薄層層析法定性檢測(cè)甘露子里水提物中是否有糖類化合物，采用理化定性檢測(cè)甘露子醇提物中是否含有黃酮類化合物。由圖1知，煎煮水提法甘露子提取物中糖類化合物的定性檢測(cè)可知，甘露子的水提取物薄層色譜法呈陽(yáng)性，從而證實(shí)煎煮水提甘露子提取物中含有葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖。由表2知，通過(guò)甘露子提取物中黃酮類化合物定性檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了含有黃酮類化合物。

2.3 甘露子提取物體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ABTS和DPPH·清除率兩種方法進(jìn)行甘露子提取物體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，利用VitC進(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)對(duì)照，水提物利用水蘇糖進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證甘露子水提物、醇提物是否有抗氧化活性，并比較水提物、醇提物清除自由基活性的大小。由圖2知，通過(guò)經(jīng)典抗氧化物質(zhì)VitC陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了水提和醇提甘露子提取物體外抗氧化活性的有效性，結(jié)果表明，甘露子水提物、醇提物都具有體外清除自由基活性，超聲醇提物清除自由基活性優(yōu)于其他方法提取物清除活性，隨著濃度增大清除能力增強(qiáng)。綜上所述，甘露子水提物與醇提物都具有體外抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文首次采用DPPH和ABTS對(duì)甘露子水提提取物和醇提提取物進(jìn)行體外抗氧化活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了水提物和醇提物對(duì)自由基都有良好的清除能力。相同濃度甘露子水提物清除自由基的能力低于醇提物清除能力，超聲醇提法優(yōu)于回流醇提法，且濃度的增加清除能力增強(qiáng)。綜上所述，甘露子提取物具有良好的體外抗氧化活性，為后續(xù)采用秀麗線蟲(chóng)進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也可將其藥理活性開(kāi)發(fā)應(yīng)用到食品和保健品中。

參考文獻(xiàn)

[1]PINTON P，RIZUTO R.Bcl-2 and Ca2+ homeostasis in the endoplas-mic reticulum. Cell[J].Death and Differentiation，2006，13（8）：1409-1418.

[2]CHEN R，VALENCIA I，ZHONG F，et al.Bcl-2 functionally interacts with inositol ?4.5-trisphosphate reeptors toregulate calcium release from the ER in respolse to inositol 1，4.5-trisphosphate[J].Journal of Cell Biology，2004，166（2）：193-203.

[3]施樹(shù)，羅章.甘露子藥食功用研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（10）：62-64.

[4]宋曉凱.天然藥物化學(xué)[M].3版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2016.

[5]姚紅，王洪新，朱松，等.草石蠶水蘇糖檢測(cè)技術(shù)的研究[J].世界科科技研究與成展，2011，33（2）：284-286.

[6]Li X.Comparative Study of 1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyil Radical （DPFH·）Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family[J].Chemistryselect，2018（3）：13081-13086.

[7]LI X，OUYANG X，CAI R，et al.3，8-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids： Evihce from Acacetin and Isoginkgetin[J].Molecules， 2019，24（11）：2039.

作者簡(jiǎn)介：劉洪巖（1982—），男，漢族，吉林長(zhǎng)春人，本科，助理實(shí)驗(yàn)師。研究方向：天然藥物成分活性研究，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥品生產(chǎn)工藝研究。

王巍（1982—），女，漢族，吉林舒蘭人，碩士，副教授。研究方向：化學(xué)制藥教學(xué)。

劉曉敏（1999—），女，漢族，內(nèi)蒙古通遼人，本科在讀，研究方向：天然藥物成分活性研究。