QuEChERS提取-EMR凈化-高效液相色譜-串聯質譜法快速測定養殖魚中的乙氧基喹啉

陳琳珊 陳佩佩 何雯倩 陳茹

摘 要：建立了高效液相色譜-串聯質譜法對養殖魚中的乙氧基喹啉進行快速測定。基于QuEChERS技術，樣品用乙腈和水提取，鹽析分層離心。經增強型基質去除固相吸附劑（Enhanced Matrix Removal，EMR）凈化后，通過電噴霧電離源（Electrospray Source Ionization，ESI）的正離子模式電離，結合多反應監測（Multiple Response Monitoring，MRM）進行采集。乙氧基喹啉標準曲線在1.0～200 μg/L范圍內呈良好線性關系，相關系數r>0.999 6，平均回收率為82.9%～105.0%，方法檢出限為10.0 μg/kg，方法定量限為30.0 μg/kg，相對標準偏差RSDs為4.64%～5.96%。該方法簡單快捷，回收率良好、靈敏度高和重現性好，可應用于實際養殖魚中乙氧基喹啉的快速測定。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜法;快速測定;水產品;乙氧基喹啉

乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EQ）是一種經化學合成的芳香胺，結構如圖1所示，呈油狀液體，具有清除自由基從而防止脂質氧化的作用，同時對蛋白質、維生素等物質也有很好的抗氧化效果[1]，因此在飼料產品市場中應用廣泛。有研究表明，一定量的乙氧基喹啉對大黃魚、雛雞具有一定的促生長作用，但過量時會產生抑制生長的作用[2-3]，同時，過量的乙氧基喹啉會對動物機體產生一定的不良影響，如400 mg/kg

的飼料添加量會使大菱鲆降低食量[4]，而15 000 mg/kg的添加量也會使大西洋鮭產生拒食現象[5]。按照歐盟規定，2018年3月31日后不允許飼料產品中有乙氧基喹啉產品添加，可見乙氧基喹啉的安全性確實存在一定的爭議，而人類作為水產品的終端消費者，乙氧基喹啉在水產品中的殘留量也會對人體存在一定的隱患。目前，我國的相關法律法規仍然允許乙氧基喹啉在飼料中添加使用，由于其效果優異，即使我國水產品行業禁用后，仍然有可能會存在一段時間的違法濫用。因此，建立水產品中乙氧基喹啉快速有效的檢測方法具有極其重要的意義。

圖1 乙氧基喹啉化學結構式

目前，對水產品中乙氧基喹啉測定方法的相關報道較少，主要為毛細管電泳法[6]、高效液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10]、液相色譜串聯質譜法[11]、氣相色譜-質譜法[12]和高分辨質譜法[13]。毛細管電泳法靈敏度高、重現性差，高效液相色譜法和氣相色譜法則存在選擇性較低的問題，高分辨質譜法價格昂貴，儀器維護成本高，難以普及，因此這些方法均難以應用于實際的大批量檢測。而液相色譜串聯質譜法、氣相色譜-質譜法則具有靈敏度高，選擇性好，應用廣泛的優點，可用于實際的批量檢測。本文建立的高效液相色譜-串聯質譜法，基于QuEChERS方法提取，增強型基質去除凈化劑EMR進行凈化，通過二次優化質譜參數，使目標物達到實際測定的最佳響應值，結合高效液相色譜，使目標物在短時間內出峰，且保持良好的峰型。同時方法學實驗數據表明，該方法可有效測定水產品中的乙氧基喹啉。

1 材料與試劑

1.1 儀器與設備

高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀，配有電噴霧電離源（ESI）（API 4000Q，AB SCIEX公司）;電子天平;4k-15離心機（北京卓明貿易有限公司）;IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實驗室技術有限公司）;Milli-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）。

1.2 材料與試劑

養殖魚樣品，購于廣州市市場。

甲酸、乙腈（LC-MS級，美國Thermo Fisher公司）;乙氧基喹啉標準品（純度≥98.5%，SIGMA，購自安譜公司）;EMR凈化管（安捷倫，購自德祥公司）;石墨化炭黑鍵合硅膠（Graphitizing of Carbon Black，GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺鍵合硅膠（Primary Secondary Amine，PSA）（購自廣州聯方公司）;無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，購自安譜公司）。

1.3 實驗條件

1.3.1 標準溶液的配制

標準溶液：稱取適量標準品，用乙腈溶解并配成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，于4 ℃下避光保存。

標準工作溶液：分別準確移取一定體積的標準儲備液，用乙腈重新定容成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L的標準工作液。

1.3.2 樣品處理

養殖魚產品先均質處理。稱取均質后樣品2.0 g（精確至0.01 g），精密稱定于50 mL離心管中，先加入水10 mL，再加入乙腈10 mL，渦旋混合2 min，然后加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取15 min，10 000 r/min離心5 min，離心后取2 mL上清液轉移至15 mL EMR脫脂凈化管（預先用1 mL水活化2 min）中，渦旋2 min后，4 500 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液于裝有0.5 g無水硫酸鎂的2 mL離心管中脫水后過膜上機。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）;柱溫為40 ℃;進樣量為10 μL;流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水（體積分數）;采用等度洗脫方式洗脫分離：A∶B為80∶20;流速為0.40 mL/min;采集時間：7 min。

1.3.4 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）;電離模式：正離子模式;離子源溫度為500 ℃，離子源電壓為5 000 V。霧化氣（GAS1）：50 psi;加熱輔助氣（GAS2）：50 psi;碰撞氣（CAD）：medium;采集模式：多反應監測（MRM）模式。

2 結果與分析

2.1 質譜分析條件的確定

建立養殖魚中乙氧基喹啉的儀器分析方法，通過流動注射的方式，將標準溶液直接注入ESI離子源，確定乙氧基喹啉的母離子質荷比為m/z 218.3，子離子質荷比分別為m/z 148.2和m/z 174.2，同時優化其去簇電壓DP和碰撞能量CE，得到最佳的參數條件，見表1。通過優化色譜條件，確定最佳洗脫流動相比例為乙腈∶0.1%甲酸水（80∶20），流速為0.40 mL/min。乙氧基喹啉標準品提取離子流色譜圖如圖2所示。

2.2 分散固相萃取劑類型的選擇

在實驗初期，探究了分散固相萃取劑類型對乙氧基喹啉回收率的影響。由于購買的EMR凈化管中包含了1.1 g的EMR凈化粉末，為了保證方法的簡便性，不再對用量進行探究，同時，用同樣量的PSA、C18和GCB凈化粉末進行回收率的對比。分別對每個用量水平重復測定6次，以平均回收率為考察依據。結果顯示，當用EMR凈化時，乙氧基喹啉的回收率最高。而且水產品中含有較多的油脂，用EMR凈化能降低儀器分析時的基質效應。因此，最終選擇EMR為凈化劑。結果詳見圖3。

2.3 基質效應

養殖魚中基質復雜，對目標物可能存在基質效應，從而影響目標物在質譜中的離子化程度，因此對乙氧基喹啉的基質效應（matrix effect，ME）進行了考察。按照前處理方法對乙氧基喹啉呈陰性的羅非魚進行處理，得到空白基質液，用此空白基質液配制50 μg/L的單標溶液，按方法的儀器條件測試，測得值和原濃度比值即為ME，以ME作為判斷的依據。當ME值在0.8～1.2時，基質效應不明顯;若ME值小于0.8，則說明基質效應為強負效應明顯，大于1.2則為強正效應。乙氧基喹啉的ME計算結果為0.92，說明基質效應不明顯，這可能是由于EMR凈化了樣品中大部分的油脂。因此，為了簡化實驗，最終采用溶劑曲線作為定量曲線。

2.4 線性關系和檢出限

在本方法所確定的實驗條件下，用乙腈將標準溶液稀釋至1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L進行測定，以峰面積（Y軸）對相應的濃度（X軸）作圖，得到線性方程Y=1.76×104X-3.92×103。結果表明，待測化合物濃度與對應的峰面積呈現良好的線性關系，相關系數r為0.999 6，具有較準確定量能力。

同時，通過對羅非魚樣品進行低濃度水平加標，再分別按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），得出方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果表明，乙氧基喹啉的方法檢出限為10.0 μg/kg，定量限為30.0 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

2.5 回收率與精密度實驗

選取均質后的樣品初步平均測定3次，確定其本底值，再進行加標回收實驗，結果見表3。最終選用乙氧基喹啉呈陰性的羅非魚和黃鱔作為加標回收樣品，按照乙氧基喹啉定量限的1倍、2倍和5倍水平進行添加，每一個水平均進行日內重復測定6次（n=6）。最終測得平均回收率在82.9%～105%，相對標準偏差RSD為4.64%～5.96%。結果表明，方法回收率良好，精密度好，滿足實驗室的測定要求。

3 結論

本文基于QuEChERS技術對樣品進行提取，選用增強型基質去除EMR粉末進行分散固相萃取凈化。建立的超高效液相色譜條件使目標物在3 min內出峰，且峰型良好。通過流動注射混合流動相的方式，二次優化目標物的質譜參數，提高了目標物的靈敏度。通過方法學實驗驗證了方法的可行性，結果表明，該方法回收率良好，靈敏度高，重復性好。在實際的樣品測定實驗中，能有效檢測出實際陽性樣品，因此，可應用于日常實驗室的檢測中，同時也為后續的相關研究提供了參考依據。

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