豬偽狂犬病毒體外誘導RAW264.7細胞炎癥反應模型的建立

任春芝 謝映紅 王秋華 韋英益 胡庭俊

摘要：【目的】探討豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染對小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）炎癥反應的影響，確定PRV的最佳感染劑量和感染時間，為建立RAW264.7細胞體外病毒感染炎癥反應模型打下基礎。【方法】PRV按10倍遞增稀釋成10-5～10-1 PRV稀釋液，感染RAW264.7細胞并孵育1.5 h，棄病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM維持培養液繼續培養，分別于繼續培養2、4、8、12、24和48 h時收集細胞上清液，采用ELISA測定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及環氧合酶（COX-1和COX-2）活性，并以CCK-8法測定細胞活性。【結果】以PRV感染RAW264.7細胞4～48 h后均能通過PCR擴增獲得PRV核酸的特異性條帶，故選擇4～48 h作為后續研究的PRV感染時間范圍;10-2 PRV～10-1 PRV感染可顯著降低RAW264.7細胞活性（P<0.05，下同），10-3 PRV組僅在培養48 h時出現下降趨勢，而10-5 PRV～10-4 PRV感染對RAW264.7細胞活性無顯著影響。PRV感染RAW264.7細胞后，其胞內炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整體上呈升高趨勢，其中10-3 PRV感染RAW264.7細胞12 h能顯著或極顯著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV～10-1 PRV感染組的IL-10分泌水平均呈升高趨勢，而10-5 PRV感染組在感染8和24 h時IL-10分泌水平明顯低于空白對照組，至感染48 h所有病毒感染組的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7細胞的COX-2活性，但對COX-1活性的影響不明顯。【結論】PRV感染能誘導RAW264.7細胞發生炎癥反應，其中10-3 PRV體外感染RAW264.7細胞8～12 h是建立RAW264.7細胞炎癥反應模型的最佳條件。該模型可應用于PRV感染與RAW264.7細胞炎癥反應相關干預藥物的研究，為進一步揭示PRV感染機理及開發抗病毒感染藥物提供理論依據。

關鍵詞： 豬偽狂犬病毒（PRV）;RAW264.7細胞;體外誘導;炎癥反應;炎癥因子;環氧合酶

中圖分類號： S852.659.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1370-08

Abstract：【Objective】The effect of inflammatory reaction on RAW264.7 cells infected with pseudorabies virus（PRV）was investigated to establish the inflammatory response model in vitro by screening the best infective dose and infective time， and provide reference for establishing RAW264.7 in vitro virus infection inflammation model. 【Method】RAW264.7 cells were infected with five different concentrations of PRV which were diluted by serial 10 times to the concentration from 1×10-5 to 1×10-1 for 1.5 h. Then the virus liquids were discarded. Subsequently， the cells were plated in DMEM with 5% calf serum and then cell supernatants were collected after cultured for 2， 4， 8， 12， 24 and 48 h respectively. The le-vels of interleukin 6（IL-6）， interleukin 10（IL-10）， interleukin 1β（IL-1β）， tumor necrosis factor Alpha（TNF-α）， monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1），interferon-γ（IFN-γ） and the activities of both cyclooxygenase 1（COX-1） and cyclooxygenase 2（COX-2） were determined by ELISA kits. The activities of cells were detected by CCK-8 method. 【Result】The specific bands of PRV nucleic acid were obtained by PCR amplification at 4-48 h post PRV infection in RAW264.7 cells， so 4-48 h was selected as the time range of PRV infection in the subsequent studies. The activities of RAW264.7 cells were significantly decreased in 10-2 PRV-10-1 PRV groups and only trended to decrease at 48 h in 10-3 PRV group（P<0.05， the same below）， however， there was no significant influence on the RAW264.7 cells activities in 10-5 -10-4 PRV groups. The secretion of inflammatory factors such as IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1 were increased in general after PRV infected RAW264.7 cells. 10-3 PRV infected RAW264.7 cells 12 h could significantly or extremely significantly（P<0.01） increase secretion levels of IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1. The secretion level of IL-10 was increased in 10-1 PRV-10-4 PRV groups， while notably lower than that in the blank control group at 8 and 24 h after infection in 10-5 PRV group， and the level was decreased at 48 h in all of the PRV infected groups. The secretion level of COX-2 was? increased for 8-24 h post infection in 10-3 PRV-10-1 PRV group， but there had no obvious effect on the secretion level of COX-1. 【Conclusion】PRV infection induces inflammatory reaction in RAW264.7 cells. 10-3 PRV infection in RAW264.7 cells in vitro for 8-12 h is considered as the optimal condition for the establishment of the inflammatory response model. This model can be applied to the study of PRV infection and inflammatory response in RAW264.7 cell which relates to the intervention action of drugs， and the results provide theoretical basis for reveal the mechanism of PRV infection and the development of anti-viral infection drugs.

Key words： pseudorabies virus （PRV）; RAW264.7 cell; in vitro induction; inflammatory response; inflammatory factor; cyclooxygenase

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32072907，31560708）

0 引言

【研究意義】豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）可引起多種家畜和野生動物發病，豬是該病毒的唯一自然宿主，仔豬感染死亡率接近100%，給全球養豬業帶來重大經濟損失（Pontes et al.，2016;梁祺英等，2017）。PRV感染新生仔豬可導致其神經系統紊亂甚至死亡，感染懷孕母豬可造成流產，感染成年豬則引發呼吸系統疾病，且急性感染存活的豬群將終生帶毒（Zhang et al.，2019）。感染PRV的豬群通過分泌物和排泄物傳播病毒，主要通過直接接觸傳播，也可通過水和污染物傳播。PRV疫苗免疫是預防豬偽狂犬病最有效的方法，Bartha-K61疫苗可有效控制PRV傳播（華濤等，2019），但無法防治PRV變異毒株引起的感染。自2011年以來，我國部分接種Bartha-K61疫苗的養豬場仍然暴發豬偽狂犬病（An et al.，2013;Freuling et al.，2017），因此急需加強PRV感染致病機理研究，以尋找理想的抗病毒感染藥物。【前人研究進展】PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒，可在幼倉鼠腎細胞（BHK-21）、胚胎成纖維細胞（CEF）、豬腎細胞（PK-15）及小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）等細胞中擴增，且研究發現擴增PRV最有效的細胞是PK-15細胞（彭麗英等，2011;李小靜和唐滿華，2015;程璇等，2020）。臧素芳等（2015）研究發現，PRV感染會減輕小鼠體重，并引起被毛凌亂及神經亢奮等癥狀，其腦組織有大量炎性細胞浸潤。肖熹玉等（2016）發現PK-15細胞的增殖在PRV感染24 h后受到顯著抑制，且與感染時間顯著相關，與感染劑量不相關，同時觀察到細胞凋亡現象。安娜等（2018）研究表明，人工感染PRV后豬體內免疫器官和下丘腦中的IL-1β表達水平顯著升高，并對豬的免疫系統產生影響。病毒感染后通常引起明顯的細胞病變，并刺激腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL）、干擾素（IFN）、趨化因子和集落刺激因子（CSF）等細胞因子過量分泌。李飛等（2016）研究發現，經豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染后，小鼠脾臟勻漿中的細胞因子分泌水平明顯升高;譚紅連等（2017）研究證實，以豬圓環病毒2型（PCV2）感染3D4/2細胞后，其TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎癥因子水平均明顯升高。另有研究發現，乙型腦炎病毒感染小膠質細胞后可引起TNF-α、IL-6和MCP-1等促炎細胞因子過量釋放，流感病毒感染宿主后則引起肺部發生急性炎癥反應，炎癥因子水平升高（莊忻雨等，2018;Dai et al.，2018）。【本研究切入點】可見，部分病毒感染可導致體內或體外的炎癥反應發生，且目前已成功建立了多種病毒感染細胞炎癥反應模型（張玲等，2016;譚紅連等，2017;羅文涓等，2018），但有關PRV體外感染RAW264.7細胞引起炎癥反應的研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】利用PRV體外感染RAW264.7細胞，測定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及COX-1和COX-2活性的變化，探討PRV感染量和感染時間與RAW264.7細胞產生炎癥因子水平的關聯性，為建立RAW264.7細胞體外病毒感染炎癥反應模型打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

PRV-GXLB-2013毒株由廣西大學預防獸醫學實驗室提供，經PK-15細胞擴增，通過Reed-Muench法測定病毒滴度為107.2 TCID50/0.1 mL;PRV特異性擴增引物（上游引物5'-CGGCTTCCACTCGCAGCT CTTCTC-3'，下游引物5'-TGTGGGTCATCACGAG CACGTACAGC-3'）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成;PK-15細胞和RAW264.7細胞由廣西大學動物科學技術學院獸醫藥理與毒理學實驗室保存提供。胎牛血清（FBS）和DMEM培養液購自美國Gibco公司;病毒基因組DNA提取試劑盒及PCR擴增試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IFN-γ、COX-1和COX-2等ELISA試劑盒均購自武漢云克隆科技股份有限公司。主要儀器設備有TS100-F倒置顯微鏡、Multimode Plate Reader多功能酶標儀、S1000梯度PCR儀和C150細胞培養箱等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 篩選病毒感染時間 將8.0 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養液加入細胞瓶，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中擴增RAW264.7細胞。待細胞鋪滿瓶底70%～80%后用細胞刮刀刮下RAW264.7細胞，按1∶3的比例進行傳代培養，待細胞達到一定數量后，取生長狀態良好的細胞進行計數，并調節細胞濃度至1×105 Cells/mL，然后接種至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養過夜，棄上清液，PBS洗3遍，分別加入PRV（200 μL/孔），繼續孵育1.5 h，用PBS洗去殘留病毒液，加入含5%胎牛血清的DMEM維持培養液繼續培養。繼續培養2、4、8、12、24和48 h后棄上清液，PBS洗2～3遍，分別收集細胞反復凍融，按照DNA抽提試劑盒說明提取DNA，并利用PRV特異性引物進行病毒核酸檢測，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1. 2. 2 試驗分組及處理 試驗設10-5～10-1 PRV稀釋濃度感染組，設未感染細胞為陰性（空白）對照。用細胞刮刀刮下培養瓶中的RAW264.7細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM完全培養液（含10%胎牛血清）輕輕吹打均勻，調整細胞終濃度為1×105 Cells/mL，接種至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2培養過夜后棄上清液，PBS洗3遍。空白對照組加入無血清的DMEM完全培養液（200 μL/孔），病毒組則分別加入不同濃度的病毒稀釋液（200 μL/孔），繼續孵育1.5 h，期間可晃動培養瓶使病毒液充分接觸細胞。孵育結束后棄病毒液，PBS清洗殘留病毒液，加入DMEM維持培養液（含5%胎牛血清）繼續培養。分別于繼續培養2、4、8、12、24和48 h時收集上清液用于測定細胞炎癥反應指標，收集上清液后剩余的細胞則用于測定細胞活性。

1. 2. 3 CCK-8法測定細胞活性 新鮮配制含10% CCK-8試劑的無血清DMEM完全培養液，按100 μL/孔的劑量加入無上清液的24孔板中，繼續孵育1.0 h，然后在酶標儀450 nm處測定OD值。

1. 2. 4 ELISA測定炎性反應指標 根據ELISA試劑盒說明分別檢測細胞上清液中的IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF-α含量及環氧合酶（COX-1和COX-2）活性。

1. 2. 5 統計分析 采用SPSS 23.0對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并以Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2. 1 PRV感染RAW264.7細胞時間的確定

RAW264.7細胞在PRV感染后繼續培養4、8、12、24和48 h，抽提病毒DNA，經PCR擴增及1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得大小約388 bp的特異性條帶，而感染后繼續培養2 h的細胞未擴增出對應的特異性條帶（圖1）。說明PRV能成功感染RAW264.7細胞，并選擇感染4～48 h的細胞進行后續試驗。

2. 2 PRV感染對RAW 264.7細胞活性的影響

如圖2所示，PRV感染RAW264.7細胞后，10-3 PRV感染組的細胞活性在感染48 h時與空白對照組相比差異顯著（P<0.05，下同）;10-2 PRV感染組的細胞活性在感染4、8和48 h時與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01，下同），在感染24 h時與空白對照組相比差異顯著;10-1 PRV感染組的細胞活性除了在感染12 h時與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05，下同）外，其他時間點均極顯著低于空白對照組。可見，10-2～10-1 PRV感染可顯著降低RAW264.7細胞活性，10-3 PRV感染僅在培養48 h時出現下降趨勢，而10-5～10-4 PRV感染對RAW264.7細胞活性無顯著影響。

2. 3 PRV感染對RAW264.7細胞分泌IL-6的影響

如圖3所示，PRV感染RAW264.7細胞后，僅10-1 PRV感染24 h、10-3 PRV感染8和12 h及10-4 PRV感染12 h的細胞內IL-6水平較空白對照組顯著升高。說明10-3 PRV感染RAW264.7細胞8～12 h能顯著提高其分泌IL-6的能力。

2. 4 PRV感染對RAW264.7細胞分泌IL-10的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細胞8 h其胞內IL-10水平極顯著升高，但至感染48 h時IL-10水平極顯著降低;10-2 PRV感染RAW264.7細胞8 h及10-3 PRV感染RAW264.7細胞8和24 h，其細胞內IL-10水平顯著高于空白對照組;10-5 PRV感染RAW264.7細胞48 h后，細胞分泌IL-10的水平極顯著低于空白對照組。可見，10-3 PRV感染RAW264.7細胞8～24 h能有效提高其分泌IL-10的能力。

2. 5 PRV感染對RAW264.7細胞分泌IFN-γ的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細胞8 h其胞內IFN-γ水平顯著升高，感染24 h極顯著升高;10-2 PRV感染4和12 h時RAW264.7細胞內的IFN-γ水平極顯著升高，感染8 h時IFN-γ水平顯著升高;10-3 PRV感染4 h時RAW264.7細胞內的IFN-γ水平呈下降趨勢，但與空白對照組相比無顯著差異，感染8和12 h時呈顯著或極顯著升高趨勢;10-4 PRV感染RAW264.7細胞12 h其胞內IFN-γ水平顯著升高。可見，10-2 PRV感染4～12 h及10-3 PRV感染8～12 h均能有效提高RAW264.7細胞分泌IFN-γ的能力。

2. 6 PRV感染對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響

如圖6所示，PRV感染RAW264.7細胞后，在各時間點其胞內TNF-α水平均高于空白對照組。其中，10-1 PRV感染RAW264.7細胞8 h時其胞內TNF-α水平極顯著高于空白對照組;10-2 PRV感染RAW264.7細胞12 h及10-3 PRV感染RAW264.7細胞8和12 h時其胞內TNF-α水平也極顯著高于空白對照組;10-4 PRV感染RAW264.7細胞24 h時其胞內TNF-α水平顯著高于空白對照組。即10-3 PRV感染8～12 h能有效提高RAW264.7細胞分泌TNF-α的能力。

2. 7 PRV感染對RAW264.7細胞分泌IL-1β的影響

如圖7所示，以10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7細胞能有效提高其胞內IL-1β的分泌水平。與空白對照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細胞4和8 h時其胞內IL-1β水平極顯著升高，感染24 h時顯著升高;10-2 PRV感染RAW264.7細胞4和12 h時其胞內IL-1β水平顯著升高;10-3 PRV感染RAW264.7細胞12 h時其胞內IL-1β水平極顯著升高。以10-5 PRV和10-4 PRV感染RAW264.7細胞，其胞內IL-1β水平的變化趨勢與空白對照組相比均無顯著差異。

2. 8 PRV感染對RAW264.7細胞COX-1活性的影響

如圖8所示，以PRV感染RAW264.7細胞，僅有10-1 PRV感染4 h及10-2 PRV感染24 h的胞內COX-1活性顯著高于空白對照組外，其他PRV濃度感染組對RAW264.7細胞COX-1活性均無顯著影響。

2. 9 PRV感染對RAW264.7細胞COX-2活性的影響

如圖9所示，以不同濃度PRV感染RAW264.7細胞4 h，其胞內COX-2活性均無顯著變化。10-1 PRV感染RAW264.7細胞8 h其胞內COX-2活性極顯著高于空白對照組，10-2 PRV感染8和24 h其胞內COX-2活性顯著或極顯著高于空白對照組，10-3 PRV感染8和24 h其胞內COX-2活性顯著高于空白對照組，而10-4 PRV感染12 h其胞內COX-2活性顯著降低。可見，10-3 PRV和10-2 PRV感染8或24 h均能有效提高RAW264.7細胞COX-2的活性。

2. 10 PRV感染對RAW264.7細胞分泌MCP-1的影響

如圖10所示，10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7細胞4、12和24 h其胞內MCP-1水平均極顯著高于空白對照組;10-4 PRV感染RAW264.7細胞4和12 h其胞內MCP-1水平也極顯著高于空白對照組。可見，10-3 PRV～10-1 PRV感染4、12或24 h均能有效提高RAW264.7細胞分泌MCP-1的能力。

3 討論

炎癥是機體對病毒或細菌感染及組織損傷等刺激的一種防御反應，但過度的炎癥反應會損傷機體，引起實質器官變性、壞死及功能衰竭。RAW264.7細胞是建立體外炎癥反應模型的常用細胞，細菌和病毒等致病因素均可誘導RAW264.7細胞產生多種細胞因子、炎性介質及趨化因子等（Lin et al.，2012;Liao et al.，2018;Tebakari et al.，2018）。本研究以RAW264.7細胞為體外炎癥反應模型細胞，通過探究病毒感染RAW264.7細胞后炎性因子的分泌水平及環氧合酶活性的變化，建立PRV感染RAW264.7細胞體外炎癥反應模型，為進一步揭示PRV感染機理及研發抗病毒感染藥物提供理論依據。

炎癥前期細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和MCP-1等具有免疫作用，可導致機體產生炎癥反應，在細胞免疫及其介導的炎癥反應中發揮重要作用（Lin et al.，2017;首姣琴等，2019）。TNF-α是重要的早期炎癥因子，調節細胞的增殖、分化及凋亡等過程，在造血和抗病毒方面具有重要意義，同時可刺激活化IL-6和IL-1β。IL-6具有抗炎和促炎的雙向功能，參與機體的免疫應答和免疫調節，IL-6在正常水平下有利于機體的防御作用，但產生過多會引起炎性損傷，在多種炎癥相關疾病中均伴有IL-6水平的升高，且對單核巨噬細胞具有趨化作用（張海等，2014;Saiki et al.，2018）。IL-1β是內皮細胞活化因子，在病毒感染機體后調節炎癥反應，常與TNF-α產生協同作用。MCP-1是由單核細胞、成纖維細胞、巨噬細胞及B細胞等分泌的小分子蛋白，是重要的促炎因子，通過吸引炎性細胞遷移至損傷部位而特異性激活單核/巨噬細胞系統（鄒莉等，2018）。張玲等（2016）研究發現，以PRRSV體外感染RAW264.7細胞，其細胞存活率明顯降低，而胞內TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IFN-γ等炎癥因子的分泌水平極顯著升高。張曉音等（2017）采用ELISA和實時熒光定量PCR檢測脂多糖（LPS）刺激后的巨噬細胞，結果表明其胞內IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的分泌水平顯著升高，即巨噬細胞發生了炎癥反應。本研究結果表明，以PRV感染RAW264.7細胞4～48 h后均能通過PCR擴增獲得PRV的特異性條帶，故選擇4～48 h作為后續研究的PRV感染時間范圍;10-5 PRV～10-3 PRV稀釋濃度對RAW264.7細胞無明顯毒性影響，可作為試驗用的安全濃度范圍。此外，PRV感染RAW264.7細胞后，其胞內炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整體上呈升高趨勢，即這些炎癥介質已參與病毒感染所致的炎癥反應過程，與張玲等（2016）的研究結果一致。

IL-10作為一種抗炎因子，能抑制單核巨噬細胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等多種炎癥因子，并降低細菌或病毒誘導所造成的損害（Villela-Castrejón et al.，2017）。有研究表明，IL-10能降低LPS誘導內毒素血癥小鼠血清TNF水平，并減輕實驗動物模型關節腫脹、細胞浸潤及細胞因子合成（濮海平，2004）。機體發生炎癥損害時，巨噬細胞在釋放促炎因子的同時釋放抗炎因子，使機體免疫應答趨于平衡，當這種平衡失調就會導致炎癥反應加重，器官功能障礙甚至衰竭。因此，一定范圍內促進細胞產生IL-10有利于治療炎癥疾病（郭偉強等，2008;張麗娜，2012）。本研究發現，PRV感染RAW264.7細胞24 h內，10-4 PRV～10-1 PRV感染組的IL-10分泌水平均呈升高趨勢，而10-5 PRV感染組在感染8和24 h時IL-10分泌水平明顯低于空白對照組，至感染48 h所有病毒感染組的IL-10分泌水平均降低。該結論揭示了炎癥反應的復雜性及IL-10的多重調節功能。環氧合酶分為COX-1和COX-2，能將花生四烯酸催化為具有活性的前列腺素，促進炎癥反應的發生，在病毒感染及LPS等刺激因子的作用下高表達，其中COX-2與炎癥發生密切相關（吳磊等，2012）。本研究中，10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7細胞COX-2活性，但對COX-1活性的影響不明顯。

4 結論

PRV感染能誘導RAW264.7細胞發生炎癥反應，其中10-3 PRV稀釋濃度體外感染RAW264.7細胞8～12 h是建立RAW264.7細胞炎癥反應模型的最佳條件。該模型可應用于PRV感染與RAW264.7細胞炎癥反應相關干預藥物的研究，為進一步揭示PRV感染機理及開發抗病毒感染藥物提供理論依據。

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（責任編輯 蘭宗寶）