大珠母貝組織蛋白酶B基因克隆及其表達分析

徐揚 王姿曼 李俊輝 梁飛龍 鄧岳文 楊創業

摘要：【目的】分析組織蛋白酶B基因（CatB）在大珠母貝（Pinctada maxima）不同組織中的表達模式，明確CatB在大珠母貝中的功能作用，為培育生長快且抗逆性強的大珠母貝提供基礎資料。【方法】利用RACE克隆大珠母貝CatB基因，利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在線軟件進行生物信息學分析，并以實時熒光定量PCR檢測CatB基因在大珠母貝外套膜（套膜區、邊緣膜區和中央膜區）、肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等組織中的表達情況?！窘Y果】大珠母貝CatB基因cDNA序列全長1365 bp，其開放閱讀框（ORF）1026 bp，5'非編碼區（5'-UTR）長度81 bp，3'非編碼區（3'-UTR）長度258 bp，共編碼341個氨基酸殘基。大珠母貝CatB蛋白分子量為37.73 kD，理論等電點（pI）為6.66，脂溶性系數為67.48，不穩定指數為31.18，親水性平均系數（GRAVY）為-0.451，為穩定的親水性蛋白;在第89～337位氨基酸存在一個Pept-C1結構域。大珠母貝CatB蛋白二級結構以無規則卷曲為主，占51.03%，α-螺旋占26.98%，β-轉角占9.09%，延伸鏈占12.90%;三級結構與馬氏珠母貝（P. fucata martensii）CatB蛋白結構相似。大珠母貝CatB氨基酸序列與馬氏珠母貝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高達90.91%;與長牡蠣（Crassostrea gigas，XP_011428258.1）、海灣扇貝（Argopecten irradians，ANG56311.1）、褶紋冠蚌（Cristaria plicata，AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分別為79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母貝外套膜的套膜區、邊緣膜區和中央膜區及肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等7個組織中均有表達，以肝胰腺中的相對表達量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05），其次是外套膜的套膜區和中央膜區?！窘Y論】CatB基因在大珠母貝肝胰腺中高表達，其次是外套膜的套膜區和中央膜區，故推測CatB是通過參與大珠母貝的消化吸收作用而調控其生長代謝過程。

關鍵詞： 大珠母貝;組織蛋白酶B（CatB）;基因克隆;組織表達;肝胰腺;消化吸收

中圖分類號： S968.316.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1353-09

Abstract：【Objective】Analyzed the expression patterns of cathepsin B gene（CatB）in different tissues of Pinctada maxima， and clarified the functional role of CatB in P. maxima， in order to provide basic information for cultivating fast-growing and stress-resistant P. maxima. 【Method】The CatB gene in P. maxima（designated as PmCatB） was obtained by RACE with ExPASy ProtParam， ExPASy ProtScale， NPS@SOPMA， SWISS-MODEL and SignalP 4.1 online softwares for bioinformatics analysis and quantitative real-time PCR was used to detect the expression level of PmCatB in different tissues including the mantle（marginal zone of mantle，pallial zone of mantle and central zone of mantle）， hepatopancreas， gill， foot and adductor muscle. 【Result】The full length of PmCatB cDNA sequence was 1365 bp， with an open reading frame（ORF） of 1026 bp， 5' untranslated region （UTR） was 81 bp， 3'? UTR was 258 bp， and encoded 341 amino acids residues. The molecular weight of PmCatB protein was 37.73 kD and the theoretical isoelectric point（pI） was 6.6. The fat solubility coefficient was 67.48， the instability index was 31.18， and the average hydrophilicity coefficient（GRAVY） was -0.451， which was a stable hydrophilic protein; there was a Pept-C1 domain at amino acids 89-337. The secondary structure prediction of PmCatB protein showed that random coils were dominant， accounting for 51.03%， α-helix accounted for 26.98%， β-turn accounted for 9.09%， and extended strand accounted for 12.90%;the tertiary structure was similar to the CatB protein structure of P. fucata martensii. The similarity between the CatB amino acid sequence of P. maxima and the P. f. martensii（ADX32985.1） was as high as 90.91%;and the similarities of the amino acid sequence of the Crassostrea gigas（XP_011428258.1）， Argopecten irradians（ANG56311.1） and Cristaria plicata（AEF32260.1） compared with P. maximawere 79.47%， 65.38% and 62.18% respectively. PmCatB was expressed in tissues including the marginal zone of mantle， pallial zone of mantle， central zone of mantle， hepatopancreas， gill， foot and adductor muscle，? the relative expression in hepatopancreas was the highest， and the relative expression level wassignificantly higher than the relative expression in other tissues（P<0.05）， and followed with the marginal zone of the mantle and the central zone of the mantle. 【Conclusion】PmCatB shows high expression in the hepatopancreas，and followed by the pallial zone of mantle and central zone of mantle， so it is speculated that PmCatB may participate in the process of growth and metabolism process bytaking part in the digestion and absorption of P.maxima.

Key words： Pinctada maxima; cathepsin B（CatB）; gene cloning; tissue expression; hepatopancreas; digestion and absorption

Foundation item： National Shellfish Industrial Technique System Construction Project（CARS-049）; Innovation Team Project of Department of Education of Guangdong（2017KCXTD016）; Guangdong Shellfish Industrial Technique System Construction Project（2020KJ146）

0 引言

【研究意義】大珠母貝（Pinctada maxima）別名白蝶貝，隸屬于軟體動物門（Mollusca）雙殼綱（Bivalvia）異柱目（Anisomyaria）珍珠貝科（Pteriidae）（唐仁生等，2009;王新星等，2016），是大型海產珍珠貝，其產生的珍珠規格大，經濟價值高（謝紹河等，2013）。大珠母貝主要分布于澳大利亞和西太平洋沿岸，在我國主要分布在海南沿海及雷州半島和西沙群島沿岸海域（姜因萍和何毛賢，2009）。我國從20世紀70年代起開始研究大珠母貝的人工繁殖及珍珠培育，但大珠母貝產業在我國并未得到快速發展，其主要原因是人工繁殖的大珠母貝成活率低，大部分貝苗生長至3 cm左右就出現大批量死亡（梁飛龍等，2011）。因此，探究大珠母貝生長代謝調節機制對于促進大珠母貝培育及珍珠養殖具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】消化酶對生物體意義重大，主要通過影響機體的營養吸收而調控其生長發育，可分為淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶三大類（潘魯青等，2006;姜愛蘭等，2020）。組織蛋白酶B（Cathepsin B，CatB）是一種蛋白水解酶，屬于木瓜蛋白酶超家族（Mort and Buttle，1997;Aggarwal and Sloane，2014），也是11種半胱氨酸蛋白酶之一，具有內切酶和二肽基羧肽酶活性（Khaket et al.，2019）。CatB首先在糙面內質網形成無活性的蛋白酶原，然后進入高爾基體進行糖基化和磷酸化形成甘露糖-6-磷酸蛋白;接著磷酸化蛋白與溶酶體中6-磷酸甘露糖受體結合，并運輸至溶酶體內（McCormick，1993;Mort and Buttle，1997）。CatB與木瓜蛋白酶超家族的其他成員相似，其蛋白酶前體酶原包括3個組成部分：信號肽、前導肽和成熟蛋白酶（韓月，2019）。在動物體內，CatB以酶原形式存在于溶酶體中，能水解多種蛋白;CatB基因是調控動物生長發育的重要候選功能基因（李勝杰等，2018），在物種間高度保守且廣泛分布（王曉梅，2008）。已有研究證實，CatB與多種人類疾病相關，具有抗腫瘤和抗癌癥作用（Sloane et al.，2005），還能促進細胞凋亡（Podgorski and Sloane，2003）。在非哺乳動物中，CatB被認為是主要的消化酶，在北極蝦（Pandalus borealis）（Aoki et al.，2003）、文昌魚（Branchiostoma belcheri）（Wang et al.，2004）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（郭慧等，2017）及皺褶冠蚌（Cristaria plicata）（Yi et al.，2018）中均有研究，且發現其在消化腺中大量表達，故推測其參與消化代謝調控。此外，有報道發現CatB參與魚類和雙殼類早期幼蟲發育階段的卵黃物質加工（Tingaud-Sequeira et al.，2011）?！颈狙芯壳腥朦c】CatB是軟體動物重要的消化酶，主要參與溶酶體蛋白降解（Aoki et al.，2003;王曉梅，2008），但有關CatB在大珠母貝中的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】采用RACE克隆大珠母貝CatB基因cDNA序列并進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測CatB基因在大珠母貝不同組織中的表達模式，明確CatB在大珠母貝中的功能作用，為培育生長快且抗逆性強的大珠母貝提供基礎資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試大珠母貝取自廣東省湛江市徐聞縣承梧村海區，挑選無病害的2齡大珠母貝，采集外套膜（套膜區、邊緣膜區和中央膜區）、肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等組織樣品，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1. 2 總RNA提取及cDNA合成

通過TRIzol提取大珠母貝7個組織總RNA，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，運用NanoDrop ND1000紫外分光光度計分析其濃度和純度。參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit說明制備5'-RACE和3'-RACE模板;并參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）說明合成cDNA模板，用于實時熒光定量PCR檢測。

1. 3 CatB基因cDNA序列克隆

從大珠母貝轉錄組數據庫中獲取CatB基因的Unigene序列，并利用Primer Premier 5.0設計特異性引物（表1），采用巢式PCR分別擴增5'末端序列和3'末端序列，PCR擴增其中間片段。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，經純化回收試劑盒分離純化的目的基因片段連接至pMD19-T載體后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，以含氨芐青霉素（Apm+）的LA培養基挑選陽性克隆菌株進行PCR檢測，并將陽性克隆菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 4 生物信息學分析

使用DNAMAN對獲得的5'末端序列、3'末端序列及中間片段進行拼接，得到大珠母貝CatB基因cDNA全長序列;采用NCBI中的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測大珠母貝CatB基因開放閱讀框及其推導氨基酸序列;利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析其編碼蛋白理化性質，采用ExPASy ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測其親/疏水性;使用NPS @SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/interactive）分別預測大珠母貝CatB蛋白的二、三級結構;運用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）預測氨基酸信號肽;使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行氨基酸結構域分析;使用NCBI中的BLAST（http：//blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）進行同源比對分析，并以MEGA 6.0構建系統發育進化樹。

1. 5 大珠母貝CatB基因組織表達分析

采用實時熒光定量PCR檢測CatB基因在大珠母貝外套膜（套膜區、邊緣膜區和中央膜區）、肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等組織中的表達情況。以β-actin為內參基因，通過2-ΔΔCt法換算大珠母貝各組織中的CatB基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），并利用SPSS 18.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 大珠母貝CatB基因cDNA序列克隆及測序結果

RACE克隆獲得大珠母貝CatB基因cDNA序列全長1365 bp，其開放閱讀框（ORF）1026 bp，5'非編碼區（5'-UTR）長度81 bp，3'非編碼區（3'-UTR）長度258 bp，共編碼341個氨基酸殘基。大珠母貝CatB蛋白分子量為37.73 kD，理論等電點（pI）為6.66。

2. 2 大珠母貝CatB蛋白理化性質分析結果

ExPASy-ProtParam分析結果表明，大珠母貝CatB蛋白的脂溶性系數為67.48，不穩定指數為31.18，屬于穩定蛋白;其親水性平均系數（GRAVY） -0.451，為親水性蛋白（圖1）。從圖2可知，大珠母貝CatB蛋白含有一個由14個氨基酸殘基組成的信號肽。經SMART分析發現，大珠母貝CatB蛋白在第89～337位氨基酸存在一個Pept-C1結構域（圖3）。大珠母貝CatB蛋白二級結構預測結果（圖4）顯示，以無規則卷曲占比最高，為51.03%，α-螺旋占26.98%，β-轉角占9.09%，延伸鏈占12.90%。SWISS-MODEL預測發現，大珠母貝CatB蛋白的三級結構與馬氏珠母貝（P. fucata martensii）CatB蛋白結構相似（圖5）。

2. 3 CatB氨基酸序列同源比對分析及系統發育進化樹構建

多序列比對分析結果（圖6）表明，大珠母貝CatB氨基酸序列與馬氏珠母貝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性最高，為90.91%;與長牡蠣（Crassostrea gigas，XP_01142825 8.1）、海灣扇貝（Argopecten irradians，ANG56311.1）、褶紋冠蚌（Cristaria plicata，AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分別為79.47%、65.38%和62.18%，說明CatB蛋白為保守蛋白?；贑atB氨基酸序列相似性，構建大珠母貝與褶紋冠蚌、海灣扇貝、長牡蠣、馬氏珠母貝、海綿（Suberites domuncula，CAH04630.1）、仿刺參（Apostichopus japonicus，AOG61243.1）、鴨嘴海豆芽（Lingula anatina，XP_013409929.1）、人類（Homo sapiens，NP_001371643.1）、果蠅（Drosophila melanogas，NP_001259536.2）、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai，AGK85259.1）、福壽螺（Pomacea canaliculata，XP_005107685.1）及海蝸牛（Aplysia californica，XP_005107685.1）的系統發育進化樹，結果（圖7）顯示大珠母貝與馬氏珠母貝等軟體動物聚為一支，其親緣關系較近，而與人類及海蝸牛等物種相距較遠。

2. 4 大珠母貝CatB基因的組織差異表達分析結果

從圖8可看出，CatB基因在大珠母貝外套膜的套膜區、邊緣膜區和中央膜區及肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等7個組織中均有表達，以在肝胰腺中的相對表達量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05），其次是外套膜的套膜區和中央膜區，而在足和閉殼肌中的相對表達量較低。

3 討論

組織蛋白酶在不同物種間具有較高的同源性，且廣泛存在，在細胞內和細胞外的蛋白降解工程中均發揮重要作用（Donald et al.，2003）。本研究通過RACE克隆獲得大珠母貝CatB基因cDNA序列全長1365 bp，其開放閱讀框1026 bp，共編碼341個氨基酸殘基。大珠母貝CatB蛋白含有一個由14個氨基酸殘基組成的信號肽，且在第89～337位氨基酸存在一個Pept-C1結構域，具有半胱氨酸蛋白酶活性，屬于水解蛋白酶。CatB是半胱氨酸蛋白酶家族的典型代表（朱鵬等，2020），能利用半胱氨酸殘基的巰基作為親核試劑，而水解蛋白的肽鍵（Barrett and Rawlings，2001）。CatB在正常情況下參與細胞內溶酶體中的蛋白降解，其活性位點呈閉合環狀結構，表現為外切酶活性;但在病理條件下，CatB參與溶酶體外的生理過程，并釋放到細胞核內的中性環境中，閉合環狀結構打開，表現出內切酶活性（黃媛等，2016）。多序列比對分析結果顯示，CatB基因在不同物種間高度保守，其中大珠母貝CatB氨基酸序列與馬氏珠母貝CatB氨基酸序列的相似性高達90.91%;基于CatB氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹也顯示，大珠母貝與馬氏珠母貝等軟體動物聚為一支，其親緣關系較近。

CatB在多種無脊椎動物中均有表達。在文蛤（Yao et al.，2011）、縊蟶（Niu et al.，2013）、皺紋盤鮑（Qiu et al.，2013）和皺褶冠蚌（Yi et al.，2018）的肝胰腺、閉殼肌、外套膜和鰓組織中均有表達，且在肝胰腺中高表達;在刺參的體腔、觸手、腸道、呼吸樹和肌肉中也有表達，以腸道中的表達量最高（Chen et al.，2017）。本研究也發現，CatB基因在大珠母貝外套膜的套膜區、邊緣膜區和中央膜區及肝胰腺、鰓、足和閉殼肌等7個組織中均有表達，以在肝胰腺中的相對表達量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達量，其次是外套膜的套膜區和中央膜區，與在文蛤（Yao et al.，2011）、縊蟶（Niu et al.，2013）、皺紋盤鮑（Qiu et al.，2013）和皺褶冠蚌（Yi et al.，2018）中的研究結果一致。肝胰腺是貝類消化代謝最旺盛的器官（王志新等，2013），CatB基因在大珠母貝的肝胰腺中高表達，故推測CatB參與大珠母貝的消化代謝過程。

CatB不僅在動物卵巢卵母細胞的發生和胚胎及幼蟲發育過程中發揮重要作用，還具有蛋白消化功能（黃媛等，2016）。Yang等（2006）研究發現CatB可分解脂肪體，并參與昆蟲的變態過程;Tingaud-Sequeira等（2011）研究表明，CatB可水解卵黃蛋白為胚胎發育提供必需的原料;Wang等（2011）通過文蛤饑餓進食推測CatB參與其營養消化代謝過程;Yao等（2011）研究認為，CatB可能通過調節消化吸收而參與文蛤的生長發育。綜合上述研究結果，進一步暗示CatB可能參與大珠母貝的消化吸收過程，但CatB對大珠母貝的具體作用機理尚未明確，有待深入探究CatB在大珠母貝生長代謝中的調控作用。

4 結論

CatB基因在大珠母貝肝胰腺中高表達，其次是外套膜的套膜區和中央膜區，故推測CatB是通過參與大珠母貝的消化吸收作用而調控其生長代謝過程。

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（責任編輯 蘭宗寶）