二甲四氯植物內(nèi)生降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究

封國君 杜良偉 龍迪 曾東強 王彥輝

摘要：【目的】篩選可降解二甲四氯除草劑的內(nèi)生真菌，研究內(nèi)生真菌對二甲四氯的降解特性和途徑，為除草劑污染的微生物治理提供理論依據(jù)。【方法】采用平板培養(yǎng)法從被二甲四氯嚴重污染的飛機草中篩選可降解二甲四氯除草劑的內(nèi)生真菌;采用形態(tài)學方法觀察內(nèi)生真菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)，結(jié)合分子生物學方法對內(nèi)生真菌的ITS、TUB和LUS序列進行克隆和測序，對內(nèi)生真菌進行鑒定;通過單因素法優(yōu)化內(nèi)生真菌在無機鹽培養(yǎng)基中對二甲四氯的降解條件（溫度、pH和營養(yǎng)源）;并采用液相色譜標準品比對、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）鑒定內(nèi)生真菌在無機鹽培養(yǎng)基中降解二甲四氯的產(chǎn)物。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別添加內(nèi)生真菌到不滅菌土壤和滅菌土壤中，同時設(shè)不添加內(nèi)生真菌的土壤為對照組，測定二甲四氯在土壤中的降解速率。【結(jié)果】從飛機草中初篩發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌可很好地降解二甲四氯，編號為E68，結(jié)合形態(tài)學和基因序列分析可將E68鑒定為樹狀炭角菌（Xylaria arbuscula）。在二甲四氯初始濃度為50.0 mg/L條件下，E68降解二甲四氯的最優(yōu)條件是pH 5.0、溫度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖，7 d后其降解率為97.03%。E68在無機鹽培養(yǎng)基中降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯。在含有2.5 mg/kg二甲四氯的土壤中添加E68，可明顯提高二甲四氯在土壤中的降解率;與不添加E68的土壤相比，在不滅菌和滅菌土壤中分別接入E68后，二甲四氯的降解半衰期分別提高2.8和2.5倍 。【結(jié)論】從飛機草中分離出的內(nèi)生真菌E68在無機鹽培養(yǎng)基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修復環(huán)境中二甲四氯污染的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 二甲四氯;生物降解;內(nèi)生真菌;樹狀炭角菌;降解特性

中圖分類號： S482.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1263-10

Abstract：【Objective】This experiment aimed to screen and identify 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid （MCPA）-degrading endophytic fungi from plants and studied the degradation characteristics and pathway of the isolated endophytic fungi to MCPA. The study provided atheoretical basis for the bioremediation of herbicide-contaminated environment. 【Method】Used plating method， endophytic fungus for degradation of MCPA were isolated from MCPA-contaminated Eupatorium odoratum. The isolated endophytic fungus was identified through morphological feature observed on the medium， combined with molecular biology method， cloning and sequencing of ITS， TUB and LUS sequences were conducted. The degradation conditions including temperature， pH， nutrition source were also optimized in the mineral salt medium by single-factor test.? The degradation product of MPCA by endophytic fungi was identified in the mineral salt medium using high performance liquid chromatography（HPLC）， gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS）.? In constant temperature incubator（30 ℃）， endophytic fungi were added into non-sterile soil and sterile soil， and soil adding no endophytic fungi was as control group， and degradation rate of MCPA in soil were detected. 【Result】An endophytic fungus strain （numbered E68）， screened from E. odoratum， could effectively degrade MCPA.The E68 was identified as Xylaria arbuscula according to the analysis of its phenotypic feature and gene sequence. When the initial concentration of MCPA was 50.0 mg/L， the optimum degradation condition of MCPA was pH 5.0， temperature 28 °C and adding 0.5% glucose，the degradation rate was 97.03% after 7 d. The main production of strain E68 degrading MCPA was 4-chloro-2-methylphenol. Adding E68 into soil with 2.5 mg/kg MCPA could increase the degradation rate of MCPA in soil. Compared with soil without E68， the half-lives of MCPA increased 2.8 times in non-sterilized soil adding strain E68 and increased 2.5 times in sterilized soil adding strain E68. 【Conclusion】The endophytic fungus E68 isolated from E. odoratum can effectively degrade MCPA in inorganic salt media and soils， and has potential value for the bioremediation of MCPA-contaminated environment.

Key words： 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid; biodegradation; endophytic fungus; Xylaria arbuscula; degradation characteristics

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）; National Natural Science Foundation of China（31660524）; Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198140）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2018YM23）

0 引言

【研究意義】二甲四氯（2-甲基-4-氯苯氧乙酸） 是苯氧羧酸類除草劑的一種，是廣西甘蔗生產(chǎn)使用最多的一種激素類除草劑，主要用于防控闊葉雜草和莎草等。二甲四氯主要加工成鹽制劑使用，其在水中的溶解度高，易隨著雨水淋溶而污染地下水（Matamoros et al.，2012;Loos et al.，2017）。研究證實，二甲四氯在土壤中殘留期相對較長，尤其在酸性土壤中殘留期更長（López-Pi?eiro et al.，2013），對生態(tài)環(huán)境有潛在風險。廣西蔗田主要為酸性土壤，且間套種多種作物，二甲四氯易對間套種作物和后茬敏感作物產(chǎn)生藥害。微生物降解是二甲四氯在土壤環(huán)境中最主要的降解方式之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌與植物互惠共生，對去除環(huán)境中農(nóng)藥等有機污染物及生態(tài)系統(tǒng)修復具有顯著效果（馮發(fā)運等，2015;Tétard-Jones and Edwards，2015;Trognitz et al.，2016）。因此，篩選具有降解二甲四氯能力的植物內(nèi)生菌并對其降解特性進行研究，對修復受二甲四氯污染的土壤和水體具有重要意義。【前人研究進展】物理和化學方法是去除土壤和水體有機物污染的高效手段（Chair et al.，2017a，2017b），但對農(nóng)業(yè)來說成本較高。自然環(huán)境中微生物資源豐富，存在大量可有效降解有機物的微生物（Ellegaard-Jensen et al.，2017;Sam et al.，2017）。研究發(fā)現(xiàn)土壤或淤泥中存在多種可降解苯氧羧酸類除草劑的細菌，Wu等（2017）分離出的Cupriavidus gilardii T-1可快速降解苯氧羧酸類除草劑2，4-D、2，4-D丁酯、二甲四氯和二甲四氯丁酯等，但對二甲四氯丁酯的降解效率遠低于二甲四氯;Xia等（2017）分離出的無色桿菌（Achromobacter sp.）可降解2，4-D最終生成3-氧代己二酸二乙酯，進入TCA循環(huán)，還可降解二甲四氯。細菌降解苯氧羧酸類除草劑2，4-D的機制研究已較清楚，主要涉及tfd基因編碼的酶催化2，4-D（Wu et al.，2017;Xia et al.，2017）。目前已分離出可降解2，4-D和二甲四氯除草劑的多種細菌，同時對2，4-D的降解機制研究較深入，但針對二甲四氯降解機制的研究較少。內(nèi)生菌是一種重要的微生物資源，既可有效降解有機物，又能與植物聯(lián)合進行生態(tài)修復，還可促進植物生長等（傅婉秋等，2017;陶佳雨等，2019）。Liu等（2014）從煙草中分離出1株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），其對二氯喹啉酸的降解率高達93%;馮發(fā)運等（2015）從小飛蓬中分離出的阪崎克羅諾桿菌屬（Cronobacter sp.）可高效降解毒死蜱，尤其是添加外源營養(yǎng)源可明顯提高其對毒死蜱的降解率;Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）分離出的2株內(nèi)生真菌擬莖點霉（Phomopsis sp.）可降解阿魏酸、肉桂酸和芥子酸等有機物，并對其降解機制進行深入研究;Wang等（2017）從甘蔗中分離出的間型脈孢菌（Neurospora intermedia）可有效降解敵草隆，鑒定代謝產(chǎn)物證明該菌通過連續(xù)脫烷基方式降解敵草隆。目前，降解二甲四氯的真菌，尤其是植物內(nèi)生真菌鮮有報道，對其降解二甲四氯的機制或途徑尚不清楚。【本研究切入點】前人主要從污染的土壤和水體中分離二甲四氯降解菌，對植物內(nèi)生真菌降解二甲四氯的研究較少，對二甲四氯的降解途徑和微生物修復土壤中二甲四氯污染的研究也鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從被二甲四氯嚴重污染的植物中分離對二甲四氯有降解效果的內(nèi)生真菌，采用形態(tài)學和分子生物學方法進行鑒定;采用單因素法優(yōu)化內(nèi)生菌降解二甲四氯的條件;運用高效液相色譜（HPLC）、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）等手段鑒定降解產(chǎn)物;在室內(nèi)可控條件下，將分離獲得的內(nèi)生菌接種到土壤中進行土壤修復研究，以期為微生物治理除草劑殘留污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試植物：飛機草，來源于生產(chǎn)二甲四氯的農(nóng)藥廠及其附近。供試除草劑：98.0%二甲四氯鈉原藥（廣西田園生化股份有限公司提供）。主要試劑：胰蛋白胨和酵母提取物（英國Oxoid公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，真菌DNA提取試劑盒（Omega Biotek公司）;Taq PCR StarMax試劑（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：安捷倫高效液相色譜儀（HPLC）（美國安捷倫科技有限公司）;光學顯微鏡（日本尼康公司）;超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）;恒溫振蕩搖床（常州翔天實驗儀器廠）;高速離心機（德國HERMLE公司）;PCR儀（杭州柏恒科技有限公司）等。

無機鹽液體培養(yǎng)基（MM）：K2HPO4 1.50 g，KH2PO4 0.50 g，NH4NO3 1.00 g，NaCl 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1000.0 mL，pH 7.0;無機鹽固體培養(yǎng)基（MMA）：MM培養(yǎng)基中加15.00 g瓊脂粉。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 內(nèi)生降解菌分離 參照Khan等（2014）的平板培養(yǎng)法分離內(nèi)生菌并略有改進。選取健康的植物組織，在超凈工作臺中用剪刀剪成約2 cm長，以75.0%酒精浸泡消毒2 min，再用2.0%次氯酸浸泡2 min，無菌水反復沖洗3～5次，在滅菌研缽中快速將組織磨碎，取100 μL磨碎的樣品溶液涂布于含二甲四氯的MMA培養(yǎng)基表面，28 ℃下培養(yǎng)7 d。用最后一次洗脫的無菌水涂布于LB和PDA培養(yǎng)基上，驗證表面滅菌效果。

在MMA培養(yǎng)基上挑取不同形態(tài)的真菌，在含二甲四氯的PDA培養(yǎng)基上進行分離純化，直至菌落單一后進行編號保存，以備后續(xù)進行鑒定和驗證降解效果。

1. 2. 2 二甲四氯降解菌鑒定 形態(tài)學鑒定：將純化好的內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察其形態(tài)，以尺子測量其直徑，采用不同方式誘導并觀察其產(chǎn)生孢子情況。

分子生物學鑒定：按照DNA抽提試劑盒說明提取真菌總DNA。采用3對引物[委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成]對內(nèi)生真菌的ITS、TUB和LSU進行PCR擴增，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×PCR StarMix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。按照表1文獻條件進行PCR擴增。測序結(jié)果與GenBank已公布的核酸序列進行同源比對。

1. 2. 3 內(nèi)生菌降解二甲四氯特性分析 單因素法優(yōu)化降解條件：分別研究不同溫度、pH和營養(yǎng)源對分離所得的內(nèi)生真菌降解二甲四氯效果的影響。二甲四氯的起始濃度均為50.0 mg/L，當pH 7.0時分別設(shè)5個不同溫度：20、25、30、35和40 ℃，測定內(nèi)生菌在5個不同溫度下對二甲四氯的降解效果，確定最佳溫度;固定培養(yǎng)溫度為30 ℃，分別采用1.0 mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)無機鹽培養(yǎng)基pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，研究pH對內(nèi)生菌降解二甲四氯的影響;在溫度為30 ℃、pH 7.0時，分別加入0.5%的淀粉、葡萄糖、蔗糖、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨等營養(yǎng)源，測定添加不同外源營養(yǎng)源時內(nèi)生菌降解二甲四氯的效果。以二甲四氯在不添加內(nèi)生菌無機鹽培養(yǎng)基中的自然降解為空白對照。

1. 2. 4 降解產(chǎn)物鑒定 按照優(yōu)化的降解條件進行降解產(chǎn)物檢測與鑒定，分別在降解5、7和14 d進行取樣，同時設(shè)空白對照，每個試驗3次重復。代謝產(chǎn)物通過標準品比對，LC-MS和GC-MS確證，HPLC法測定降解產(chǎn)物的變化規(guī)律。

1. 2. 5 土壤修復試驗 添加回收試驗：稱取空白土壤樣品20 g，土壤二甲四氯添加水平分別為0.50、1.25和2.50 mg/kg，并設(shè)空白對照，在25 ℃下放置4 h。將上述土壤轉(zhuǎn)用40 mL乙腈振蕩提取1.5 h，加入5 g NaCl，4000 r/min離心5 min，吸取上清液30 mL，經(jīng)3 g無水MgSO4吸水后4000 r/min離心5 min，取上清液20 mL用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃下旋蒸至干，用2 mL乙腈定容后過有機相膜，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中待測（程靜等，2010）。

土壤修復試驗：設(shè)滅菌土壤、滅菌土壤+內(nèi)生真菌、不滅菌土壤和不滅菌土壤+內(nèi)生真菌4個處理，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。準確稱取陰干粉碎的土壤20 g放入三角瓶中，滅菌土壤在121 ℃下20 min滅菌后添加菌液，非滅菌土壤直接添加菌液進行土壤修復試驗。土壤中二甲四氯含量為2.5 mg/kg，接入10.0 mL在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的真菌培養(yǎng)液，同時設(shè)PDB培養(yǎng)基作對照，分別于培養(yǎng)0、3、5、7、10和14 d取樣，每個樣品3個重復，培養(yǎng)過程中在無菌環(huán)境下接入無菌水以防止土壤干燥（Chen et al.，2011a，2011b）。

1. 3 儀器條件

高效液相色譜儀1260 HPLC-UV，其色譜柱為安捷倫XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），流動相為甲醇∶水（含0.2%乙酸）=70∶30等度洗脫，UV波長230 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，二甲四氯和產(chǎn)物4-氯-2-甲基苯酚在液相色譜的保留時間分別為6.3和7.6 min（簡秋等，2015）。

液質(zhì)聯(lián)用儀TSQ Endura（賽默飛世爾科技公司）條件參照程靜等（2010）的方法。色譜柱：Hypersil GOLD C18（2.1×100 mm 1.9 Micron）;流速：0.3 mL/min;進樣量：5 μL;柱溫：35 ℃;APCI離子源，正負離子模式;霧化氣：氮氣;離子傳輸管溫度：320 ℃;噴針溫度：400 ℃;流動相為甲醇和水，采用梯度洗脫。

氣質(zhì)聯(lián)用儀為7890A-5975C（安捷倫科技有限公司），色譜柱DB-1701MS;氦氣流速1 mL/min;采用不分流進樣量模式，進樣量1 μL;柱溫箱采用程序升溫：初始溫度40 ℃保持3 min，8 ℃/min升至230 ℃，保持20 min;進樣口溫度250 ℃;接口溫度280 ℃;EI離子源。

1. 4 數(shù)據(jù)處理分析

二甲四氯降解率（η，%）按公式（1）計算：

式中，C0為空白對照中二甲四氯總濃度（mg/L），Ct為t 時間樣品培養(yǎng)液中二甲四氯殘留濃度（mg/L）。

二甲四氯降解動力學方程采用指數(shù)回歸方程（2）計算：

Ct=C0e-kt? ? ? ? ? ?（2）

式中，C0為二甲四氯初始濃度（mg/L）;Ct為t 時間二甲四氯殘留濃度（mg/L）;k為降解速率常數(shù);t為二甲四氯與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)的時間。

半衰期按照公式（3）計算：

t0.5=[Ln2k]

式中，t0.5為二甲四氯的降解半衰期。

2 結(jié)果與分析

2. 1 二甲四氯降解菌鑒定結(jié)果

初篩發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌對二甲四氯具有較好的降解效果，編號為E68，選取E68為研究對象，提交至菌種保藏中心，編號為GDMCC No.60162。

2. 1. 1 E68形態(tài)學鑒定 將E68接種至含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中于28 ℃下培養(yǎng)，結(jié)果顯示，E68的生長速度為4.5 mm/d，菌絲白色，輻射匍匐狀，菌落中心與邊緣厚度基本一致，菌落邊緣呈雪花狀，培養(yǎng)30 d后，表面長出黑色斑塊（圖1）。光學顯微鏡下觀察，E68菌株的菌絲透明、有隔（圖2）。采用環(huán)境脅迫、紫外照射和紫羅蘭培養(yǎng)等多種方式培養(yǎng)，均未觀察到該菌產(chǎn)孢現(xiàn)象。

2. 1. 2 序列分析 對E68的ITS、TUB和LSU進行PCR擴增，測序長度分別為547、412和911 bp，將序列提交至NCBI，ITS、TUB和LSU的序列號分別為KY797679.1、MW380415.1和MW520950.1。3個序列經(jīng)NCBI比對，發(fā)現(xiàn)E68與NCBI已公布的炭角菌屬（Xylaria sp.）同源性高達99%。根據(jù)Wendt等（2018）的方法，基于ITS和TUB序列串聯(lián)分析，使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3），結(jié)果顯示其與Xylaria arbuscula的相似度最高;LSU序列與3株X. arbuscula（MN611207.1、KY610463.1和MN611203.1）菌株的相似性均高于99%，因此鑒定E68為樹狀炭角菌（X. arbuscula）。

2. 2 降解特性鑒定結(jié)果

2. 2. 1 降解pH優(yōu)化 為評估pH對E68降解二甲四氯效果的影響，將無機鹽培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在30 ℃、150 r/min的搖床上連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖4）顯示，在pH 5.0時對二甲四氯的降解率最高，為95.93%;其次在pH 4.0時降解率為94.38%;pH 6.0～pH 9.0時降解率隨著pH的升高而降低。所有空白對照的降解率均小于5.00%。因此，確定E68在酸性條件下降解二甲四氯的效果優(yōu)于中性和堿性，最優(yōu)pH為5.0。

2. 2. 2 降解溫度優(yōu)化 為研究溫度效應(yīng)，無機鹽培養(yǎng)基設(shè)為pH 7.0，按試驗設(shè)計將搖床設(shè)為5個不同溫度，于150 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)溫度為25 ℃時對二甲四氯的降解效率最高，為51.49%;隨著溫度升高或降低，E68對二甲四氯的降解效率均呈下降趨勢，其在20、30、35和40 ℃時的降解率分別為45.61%、50.97%、23.98%和7.30%。空白對照的降解率小于5.00%。因此，確定E68最佳降解溫度范圍為25～30 ℃，后續(xù)試驗選擇28 ℃作為最優(yōu)溫度。

2. 2. 3 外源營養(yǎng)源優(yōu)化 研究E68在分別添加葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、淀粉、酵母提取物和蛋白胨等營養(yǎng)源的MM培養(yǎng)基中降解二甲四氯的效果，以二甲四氯為唯一碳源作對照（CK），不添加E68的MM培養(yǎng)基為空白對照，在28 ℃、150 r/min的搖床上連續(xù)培養(yǎng)7 d，結(jié)果（圖6）表明，添加淀粉、葡萄糖和蔗糖等營養(yǎng)源時，E68對二甲四氯的降解率明顯高于二甲四氯作為唯一碳源的降解率，但添加牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨時降解率明顯降低，可能是改變了該內(nèi)生菌的代謝途徑。因此，后續(xù)降解動力學研究中加入葡萄糖作為碳源。

2. 2. 4 E68降解二甲四氯動力學 在二甲四氯初始濃度為50.0 mg/L條件下，E68降解二甲四氯的最優(yōu)條件為pH 5.0、溫度28 ℃和添加0.5%的葡萄糖。在優(yōu)化后的條件下，測定E68在無機鹽培養(yǎng)基中對二甲四氯的降解動力學。分別于培養(yǎng)1、3、5、7、10和14 d后采樣，結(jié)果顯示，培養(yǎng)1 d后降解率高達88.46%，隨時間降解率逐漸增高，分別為94.04%、95.20%、97.03%、97.71%和98.46%，其降解動力學方程為y=11.71e-0.233x，半衰期為3.0 d。

2. 3 降解產(chǎn)物鑒定結(jié)果

3個標準品甲基對苯醌、二甲四氯和4-氯-2-甲基苯酚在液相色譜上的保留時間分別為4.1、6.3和7.6 min，經(jīng)時間比對4.1和7.6 min出現(xiàn)相同的峰（圖7-A和圖7-B）。液質(zhì)聯(lián)用儀上4-氯-2-甲基苯酚的保留時間為2.87 min，分子量m/z 141.0特征離子碎片為m/z 105.1和35.5（圖7-C和圖7-D）;雖然液相色譜上出現(xiàn)與甲基對苯醌保留時間一致的色譜峰，但在液質(zhì)聯(lián)用儀上未鑒定到甲基對苯醌。經(jīng)氣質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該代謝產(chǎn)物在氣質(zhì)聯(lián)用儀上保留時間為15.5 min，通過數(shù)據(jù)庫比對該產(chǎn)物確定為4-氯-2-甲基苯酚（4-Chloro-2-methylphenol）（圖7-E和圖7-F）。結(jié)合標準品、氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用最終鑒定出內(nèi)生菌E68降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯酚。該降解產(chǎn)物培養(yǎng)第5 d時在無機鹽培養(yǎng)基中的含量為1.41±0.15 mg/L，隨著時間延長含量緩慢下降，在培養(yǎng)7和14 d時的含量分別為1.26±0.09和1.09±0.17 mg/L。

2. 4 土壤修復試驗結(jié)果

2. 4. 1 土壤添加回收試驗 當土壤中二甲四氯添加水平分別為0.50、1.25和2.50 mg/kg時，按1.2.5的方法進行回收試驗，結(jié)果（表2）顯示，3個添加水平的平均回收率分別為100.07%、96.26%和98.71%，滿足農(nóng)藥殘留試驗準則要求，證明該方法可有效提取土壤中殘留的二甲四氯。

2. 4. 2 E68降解土壤中二甲四氯的效果 在滅菌和不滅菌土壤中分別加入E68，培養(yǎng)14 d后二甲四氯在滅菌土壤、滅菌土壤+E68、不滅菌土壤和不滅菌土壤+E68處理的降解率分別31.6%、57.5%、51.7%和85.5%，其降解動力學結(jié)果見表3。結(jié)果表明，二甲四氯在滅菌土壤中的降解率明顯低于不滅菌土壤，可能與不滅菌土壤中含有豐富的微生物有關(guān);與不添加E68的土壤相比，在滅菌和不滅菌土壤中分別接入內(nèi)生菌E68后，二甲四氯的降解半衰期分別提高2.5和2.8倍。說明在土壤中添加E68可明顯提高二甲四氯在土壤中的降解率。

3 討論

內(nèi)生菌廣泛分布于植物體內(nèi)，因具有促進植物生長和對污染物生物修復等優(yōu)點而備受關(guān)注（傅婉秋等，2017;Deng and Cao，2017;劉劍金等，2019）。目前已分離出多個屬的內(nèi)生真菌可降解農(nóng)藥、塑化劑和環(huán)烴類污染物等，一些內(nèi)生菌還具有緩解重金屬對植物毒害等特點（Deng and Cao，2017;傅婉秋等，2017;韓飛等，2020）。田林雙等（2007）、Xie和Dai（2015a，2015b）、Xie等（2016）研究證實擬莖點酶屬（Phomopsis sp.）內(nèi)生真菌對多種有機物有較好的降解效果。封國君（2017）從農(nóng)藥廠附近的植物中分離出多株可降解二甲四氯的內(nèi)生真菌，并證實其具有很好的生物修復效果。Wang等（2017）也從甘蔗中分離出可降解敵草隆的內(nèi)生真菌間型脈孢菌（Neurospora intermedia）。本研究在植物中分離出的炭角菌可有效降解二甲四氯，在土壤中也有明顯的修復效果，豐富了降解有機物的內(nèi)生菌資源。

環(huán)境因素（溫度、pH和營養(yǎng)源）明顯影響微生物降解有機物的效果，不同的內(nèi)生菌只有在最優(yōu)的條件下才能發(fā)揮其最佳降解效果（Stumpe and Marschner，2009）。Maqbool等（2016）報道認為真菌降解農(nóng)藥取決于環(huán)境的溫度、pH和營養(yǎng)源等。Wu等（2017）報道C. gilardii T-1在25～37 ℃時對苯氧羧酸類除草劑2，4-D具有較好的降解效果，30 ℃時效果最佳，當達42 ℃時降解被抑制;該菌在pH 5～8時對2，4-D有較好的降解效果;還發(fā)現(xiàn)菌株C. gilardii T-1在30 ℃的無機鹽培養(yǎng)基中對二甲四氯7 d的降解率高達99.7%。Xia等（2017）也發(fā)現(xiàn)溫度和pH等顯著影響降解菌對苯氧羧酸類除草劑的效果，額外添加營養(yǎng)源雖然可增加降解菌的生長，但對二甲四氯的降解效率無影響。本研究發(fā)現(xiàn)通過改變溫度可明顯影響E68對二甲四氯的降解率，溫度在25～30 ℃時有較好的降解效果，可能是溫度影響該菌的活性，從而導致對二甲四氯的代謝率下降。E68在酸性條件（pH 4.0～5.0）下對二甲四氯的降解效果更優(yōu)，可能是由于分離獲得的菌生活環(huán)境不同所致。添加牛肉膏、蛋白胨和酵母提取物明顯降低E68對二甲四氯的降解率，推測這些營養(yǎng)源抑制降解二甲四氯酶的活性;添加葡萄糖、蔗糖和淀粉后明顯提高該菌對二甲四氯的降解率，可能該菌以共代謝的方式降解二甲四氯（Mai et al.，2004）。內(nèi)生菌存活于植物體內(nèi)，通過攝取植物體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)生長，同時在外源營養(yǎng)物質(zhì)的作用下誘導內(nèi)生菌產(chǎn)生可降解有機污染物的酶，在酶的作用下可有效降解有機物。Urbaniak等（2019）、Nowak等（2020）研究表明，在土壤中添加外源物質(zhì)可提高微生物的豐度和誘導產(chǎn)生多種降解二甲四氯的基因，提高微生物對二甲四氯的降解效果。

目前對于內(nèi)生菌降解二甲四氯的機制尚不明晰。本研究通過標品和質(zhì)譜等手段鑒定出E68降解二甲四氯的主要產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯酚，但該降解產(chǎn)物的含量較低，可能是一些產(chǎn)物的中間體，也可能是該菌產(chǎn)生酶催化二甲四氯生成4-氯-2-甲基苯酚，但其具體的酶學機制尚未清楚。Li等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，炭角菌能有效降解西維因的機制可能與漆酶、細胞色素P450酶以及酯酶有關(guān)。因此，需進一步深入研究E68對二甲四氯的酶學降解機制。

近年來，利用植物內(nèi)生菌定殖于植物體內(nèi)對環(huán)境污染物進行生物修復已成為研究熱點（傅婉秋等，2017）。但微生物修復環(huán)境污染物在實際應(yīng)用中也存在諸多問題（Maqbool et al.，2016;Deng and Cao，2017;Kumar and Sharma，2019），如內(nèi)生菌是如何定殖到植物中，以及如何與植物聯(lián)合降解有機污染物尚不清楚，微生物投放到環(huán)境中的影響和生態(tài)學效應(yīng)的研究也不夠深入。本研究將分離獲得的E68接種至土壤中能有效降低二甲四氯的含量，但試驗是在室內(nèi)條件下進行，對田間修復效果還有待進一步驗證。內(nèi)生菌與植物聯(lián)合降解二甲四氯的研究尚未開展，其降解機制還需進一步探究。

4 結(jié)論

從飛機草中分離出的內(nèi)生真菌E68在無機鹽培養(yǎng)基和土壤中可有效降解二甲四氯，具有修復環(huán)境中二甲四氯污染的應(yīng)用潛力。

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（責任編輯 麻小燕）