MiR-27與miR-29在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及相關(guān)中藥研究應(yīng)用＊

葛 凡，薛 梅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 南京210023）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病病人最多發(fā)常見的微血管并發(fā)癥。該病病變通常累及全腎，臨床上以持續(xù)蛋白尿、腎小球?yàn)V過率（Glomerular Filtration Rate，GFR）進(jìn)行性下降、高血壓、水腫與貧血為主要發(fā)病特征。全世界范圍內(nèi)，隨著人口老齡化程度加大和糖尿病患病率的持續(xù)增長(zhǎng)，DN的發(fā)病率逐年遞增，已成為終末期腎臟病（尿毒癥）的第二誘因，亦是糖尿病患者致死致殘的重要原因。DN的發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是糖尿病引發(fā)多種代謝紊亂共同作用的結(jié)果，如遺傳易感性、糖代謝紊亂、腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變、氧化應(yīng)激及激素異常等均起到非常重要的作用[1-2]。西醫(yī)治療以控制血壓、控制血脂、抗炎為主[3]。臨床上，PPAR-γ（過氧化物酶體增殖物激活受體-γ）激動(dòng)劑、雷公藤多苷、卡托普利和螺內(nèi)酯的組合等[4-5]均可用來(lái)治療DN，但效果有限，且存在一定的副作用。

DN在中醫(yī)學(xué)歸屬于“消渴”、“腎消”范疇，它是由于消渴病程日久，遷延引發(fā)水腫、腰痛、尿濁等并發(fā)癥，與稟賦不足、飲食不節(jié)、情志不舒、勞逸過度、失治誤治等導(dǎo)致的臟腑功能失調(diào)有關(guān)，基本病機(jī)為“虛、瘀、濁”，脾腎兩虛是其常見的證型[6]。DN由于病情特殊，一般需要較長(zhǎng)的治療周期，患者長(zhǎng)久服藥治療造成氣虛無(wú)力、瘀血阻滯，而瘀血阻滯造成患者腎臟脈絡(luò)不通，進(jìn)一步造成患者產(chǎn)生蛋白尿，而蛋白尿頑固難消，治標(biāo)需治本，必須活血化瘀方能見效。因此，在治療上早期應(yīng)注重“扶正”，多用益氣養(yǎng)陰之法，兼顧調(diào)理肝脾腎三臟氣機(jī)；病情進(jìn)展較深，病理產(chǎn)物積聚，則治以“驅(qū)邪”為主[7]。中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)在于“整體論治”和“多靶點(diǎn)干預(yù)”，中藥復(fù)方的療效潤(rùn)物無(wú)聲、平波緩進(jìn)，且無(wú)突出不良反應(yīng)，臨床可長(zhǎng)期服用，愈來(lái)愈受到廣泛的重視和認(rèn)可。中醫(yī)辨證論治的治療方法較西醫(yī)治療更為有效，能明顯改善患者的臨床癥狀，總的有效治愈率可達(dá)到80%以上（P<0.05）[8]。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性約含有19~24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA。MiRNA可以減少目的基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化的過程[9]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)腎纖維化與miRNA關(guān)系的深入研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化各進(jìn)展期中，miRNAs通過抑制靶基因，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血管緊張素II、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)堆積等，抑制纖維化信號(hào)通路進(jìn)而影響腎纖維化。文獻(xiàn)報(bào)道，MiR-571、miR-152、miR-1303、miR-192、miR-200、miR-21、miR-146、miR-23、miR-145、miR-126、miR-29、miR-377等多種miRNAs均參與了DN的發(fā)生與發(fā)展過程[10-12]。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們用已定量成分的中藥方劑含藥血清干預(yù)高糖培養(yǎng)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK2），細(xì)胞樣本高通量miRNAs測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，樣品組20種miRNAs具有顯著差異。通過qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證與DN相關(guān)的5種miRNAs表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，其中，miR-27a-5p表達(dá)下調(diào)更為顯著。因此，我們選擇實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的miR-27和miR-29兩種表達(dá)有顯著差異的miRNA參與調(diào)控糖尿病腎病關(guān)系、下游信號(hào)通路及相關(guān)中藥研究應(yīng)用予以綜述。

1 miR-29參與調(diào)控DN的分子機(jī)制

MiR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，它們只在2-3個(gè)堿基（miR-29a和miR-29b1以及miR-29c和miR-29b2）上有所不同，分別由位于7號(hào)染色體或1號(hào)染色體上的兩個(gè)基因串聯(lián)編碼和轉(zhuǎn)錄。MiR-29已被證明參與抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，表明具有抗纖維化功能。Targetscan（靶點(diǎn)預(yù)測(cè)）預(yù)測(cè)程序表明[13]，miR-29家族有可能通過與其3'UTR結(jié)合，抑制多種膠原蛋白（col1a1、col2a1、col3a1、col4a1、col4a3、col4a5、col5a1、col5a2、col6a3等）的合成。同時(shí)，有研究結(jié)果表明[13]，miR-29家族異常表達(dá)，參與了肝臟、腎臟、心肌、肺等多個(gè)組織器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展。可以確定miR-29參與了DN的發(fā)生與發(fā)展，有望成為治療DN的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

TGF-β/Smads是目前公認(rèn)促腎纖維化最主要的信號(hào)通路，miRNAs通過抑制靶基因，正或負(fù)反饋?zhàn)饔糜赥GF-β/Smads及其他纖維化信號(hào)通路，在腎纖維化各進(jìn)展期發(fā)揮調(diào)控作用。TGF-β1被認(rèn)為是腎纖維化的關(guān)鍵介體，主要通過激活其下游Smad信號(hào)通路引起腎纖維化。

近期，有研究指出[14]，Smad3，而不是Smad2，是響應(yīng)TGF-β1和TGF-β1/Smad3信號(hào)纖維化的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能夠抑制miR-29表達(dá)發(fā)揮作用，促進(jìn)腎臟纖維化。此外，miR-29也參與了DN腎纖維化的病理過程。在db/db小鼠DN的實(shí)驗(yàn)[15]研究中，miR-29過度表達(dá)減弱了腎小球系膜細(xì)胞中晚期糖基化末端（AGE）誘導(dǎo)的TGF-β/Smad3介導(dǎo)的纖維化；Western印記、免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)PCR也表明，miR-29b治療能抑制db/db小鼠的腎纖維化。同時(shí)，Qin等人[16]通過實(shí)驗(yàn)證明了miR-29是TGF-β/Smad3介導(dǎo)的纖維化的下游抑制劑。以上研究均提示，miR-29對(duì)腎臟能發(fā)揮一定的保護(hù)作用，需更進(jìn)一步研究miR-29在腎纖維化中的作用，其可能具有進(jìn)行性腎纖維化的治療潛力。

miR-29已被證明在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transformation，EMT）中發(fā)揮重要作用，可能有助于EMT的調(diào)節(jié)。研究表明，TGFβ可以通過介導(dǎo)PI3K-AKT信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)；MiR29的過表達(dá)可致使PI3K和AKT表達(dá)細(xì)胞磷酸化水平明顯下降，并抑制其對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲，從而抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，減低膠原的表達(dá)[17]。此外，Hu等人[18]發(fā)現(xiàn)miR-29b通過PI3K/AKT信號(hào)通路在Ang II誘導(dǎo)的EMT負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此，提高miR-29水平或阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路可能是治療腎間質(zhì)纖維化的新靶點(diǎn)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化以及極化過程中具有重要作用[19]，能通過抑制糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）介導(dǎo)的磷酸化作用以及抑制胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）降解等作用來(lái)誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)換。研究表明[20]，miR-29的過表達(dá)抑制了TGF-β誘導(dǎo)的Wnt3α的表達(dá)，從而間接抑制了βcatenin活化的過程。所以，miR-29可以通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)膠原表達(dá)的調(diào)控，減少EMT的積聚。

PTEN（磷酸酶基因）是miR-29的直接靶標(biāo)，miR-29a通過靶向下調(diào)PTEN促進(jìn)Akt磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力[21]。PTEN能負(fù)性調(diào)節(jié)Akt,降低Akt磷酸化水平，而Akt能促進(jìn)EMT發(fā)生。梁媛等人[22]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29a的表達(dá)水平可能通過上調(diào)靶基因PTEN，推動(dòng)Akt磷酸化,抑制EMT的發(fā)生。

2 miR-27參與調(diào)控DN的分子機(jī)制

MiR-27家族，包括miR-27a和miR-27b，是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝和心血管疾病生理過程中的新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。值得注意的是，近年來(lái)報(bào)道I型和II型糖尿病患者血循環(huán)miR-27a水平增高，對(duì)行腎活檢的DN患者52例研究發(fā)現(xiàn)患者血漿miR-27a上升，腎功能惡化。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可通過靶向抑制PPAR-γ而誘導(dǎo)NRK（大鼠腎細(xì)胞）-52E細(xì)胞纖維化，其機(jī)制或許與TGF-β1/Smad3通路的激活有關(guān)[23]。因此，研究miR-27如何調(diào)控DN疾病進(jìn)程，并明確miR-27靶基因及與下游信號(hào)通路的關(guān)系，將為尋找或闡明嶄新的治療藥物與方法提供重要的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)[24]，PPAR-γ是miR-27a的直接下游靶基因，miR-27a通過直接靶向PPAR-γmRNA的3'UTR使其磷酸化，抑制PPAR-γ水平，進(jìn)而使TGF-β1/Smad3信號(hào)通路激活，促進(jìn)ECM的產(chǎn)生及蓄積。因此，抑制miR-27a的過表達(dá)，可能能夠有效減少ECM的積聚。

Wnt3a已被證實(shí)為miR-27a-3p的靶基因。MiR-27a-3p可能通過靶向沉默Wnt3a，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位,從而抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路，減少Col1、Col3合成[25]，間接減少ECM的積聚。

Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑中有四種核心蛋白激酶，Ras、Raf、MEK和ERK。在細(xì)胞表面，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活通過配體與受體酪氨酸激酶（RTK）的結(jié)合而啟動(dòng)，然后在細(xì)胞核中，四種核心蛋白激酶Ras、Raf、MEK和ERK磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[26]。MiR-27a-3p可能通過干擾Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制ECM的合成與積聚[27]。

3 中醫(yī)藥干預(yù)下miRNAs參與調(diào)控DN的研究概況

中醫(yī)治療糖尿病腎病的方法很多，中草藥是最主要的形式。以miR-27和miR-29為代表的miRNAs作為參與DN發(fā)生發(fā)展的重要物質(zhì)，在中藥單體、提取物或復(fù)方治療DN的過程中，均能夠通過上調(diào)或下調(diào)自身的表達(dá)，從而保護(hù)腎臟，達(dá)到改善DN的效果。我們總結(jié)了近年中藥單體、提取物、復(fù)方治療DN相關(guān)研究（表1），以期為后續(xù)臨床研究及傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用拓展奠定基礎(chǔ)。

表1 中藥單體、中藥提取物、中藥復(fù)方治療DN相關(guān)研究

續(xù)表

4 結(jié)語(yǔ)

DN是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，腎間質(zhì)纖維化是其主要病理變化之一。臨床雖有一些藥物可用，但它們只能暫時(shí)緩解癥狀或阻礙一些患者DN的進(jìn)展。因此，我們迫切需要新的治療策略來(lái)控制DN。目前，miRNA已被廣泛用作DN臨床診斷和治療的生物標(biāo)志物。腎組織、外周血和尿液中miRNA的特異性變化可通過不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)，調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝異常、免疫反應(yīng)和纖維化，影響DN的進(jìn)展，恢復(fù)正常的腎功能。中醫(yī)藥無(wú)論是單體、提取物或復(fù)方，都具有多途徑、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。在DN發(fā)生發(fā)展過程中，以miR-27和miR-29為代表的miRNAs，在中醫(yī)藥干預(yù)下，可以通過抑制靶基因，進(jìn)而調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)堆積等，抑制下游信號(hào)通路進(jìn)而影響腎纖維化，達(dá)到改善DN的效果。然而，miRNAs與DN的研究和臨床應(yīng)用仍存在許多挑戰(zhàn)，單個(gè)miRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的確切調(diào)控和特異功能仍需全面了解，與DN診斷相關(guān)的miRNAs的前瞻性驗(yàn)證、大樣本量、多中心、多民族患者研究仍然缺乏。為了更好地理解miRNAs在DN中的調(diào)控和功能，仍需要進(jìn)行大量的研究。MiRNAs干預(yù)治療DN的前景正在顯現(xiàn)，今后，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，通過研究miRNA如何調(diào)控DN疾病進(jìn)程，并明確miRNA靶基因及與下游信號(hào)通路的關(guān)系，將為尋找或闡明嶄新的DN治療藥物與方法提供重要的理論依據(jù)。