濟陰顆粒對去勢雌性血脂異常大鼠的影響＊

趙磊，李淼，黃赫，劉禾，朱競赫，甘雨，劉小虎＊＊，梁茂新，2，李國信＊＊

（1.遼寧省中醫藥研究院科研處沈陽110034；2.遼寧中醫藥大學藥學院大連116600）

血脂異常一般指血漿中脂質異常，通常表現為血漿中甘油三酯（TG）和（或）總膽固醇（TC）升高，也包括低密度脂蛋白（LDL-C）升高和高密度脂蛋白（HDLC）降低。血脂異常是冠心病、心肌梗死和缺血性腦卒中等疾病的獨立危險因素[1]，49.2%的心肌梗死與其相關，且女性比男性相關性更強[2]。近30年，中國人群血脂異常患病率逐年遞增[3]。女性絕經后的發生率明顯上升[4]，患病率高達72.80%[5]，可見女性患病的特殊性和嚴重性。故圍絕經期及絕經后的血脂管理對于減輕女性長遠期疾病負擔具有關鍵意義[6]。近年來，許多研究也發現女性血脂異常與雌激素關系密切，GPR30/PPARγ/MAPK是與二者皆相關的信號通路，具有重要的調控作用。

目前治療女性血脂異常的方法并沒有充分意識其患病的特殊性，一般在發現疾病后采用常規降血脂類藥物控制，缺乏具有針對性的防控措施，同時患者需要終身服藥，經濟負擔較重。若在調節絕經綜合征的同時能夠干預脂質代謝過程則可達到有效防治目的，事半功倍。中醫認為血脂歸于“痰”類，“痰之本無不在腎”。絕經期婦女“年過四十，而陰氣自半也”“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通”肝腎陰虛明顯。濟陰顆粒是利用自身研制的“《普濟方》數據庫管理系統”，總結古代用藥規律，結合現代臨床經驗篩取所得，由生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏組成，滋補肝腎，理氣活血。前期研究表明[7-9]，濟陰顆粒可有效調節絕經綜合征癥狀、雌激素水平，抑制卵巢細胞凋亡，且5味中藥分別可抑制脂肪酸、膽固醇合成，促進脂肪分解代謝等，具有現代藥理學調節血脂作用。因此，本研究考察濟陰顆粒治療去勢雌性血脂異常大鼠的療效及其對GPR30/PPARγ/MAPK信號通路的影響，為女性圍絕經期和長遠期疾病，如血脂異常、冠心病防治，中藥新藥研發提供新思路、新方法。

1 材料

1.1 動物

SPF級、雌性SD大鼠75只，體質量160-200 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。實驗大鼠飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心。飼養條件：溫度20-25℃，濕度40-50%，自由飲食飲水。水及飼料均經輻照消毒處理。所有研究人員人道地進行動物實驗，遵守動物實驗的各項倫理條例。

1.2 藥品

注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F8008502）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號：X67405）、珍珠靈芝片（湖南正清制藥集團股份有限公司，國藥準字Z43020830）；濟陰顆粒〔生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏免煎顆粒劑（江陰天江藥業有限 公 司，批 號：18334517、18112331、19032831、19051161、19032251）〕。

1.3 主要試劑

膽固醇、丙基硫氧嘧啶、吐溫-80、1,2-丙二醇、膽酸鈉（成都華夏化學試劑有限公司，批號：P354464、P436521、P354672、P453641、P243652），TG、TC酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：12/2019）、G蛋白偶聯受體30抗體（GPR30）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、過氧化酶活化增生受體γ（PPARγ）抗體（上海酶聯生物科技有限公司，批號：AD03031236、AI09293131、AI09064702）、β-actin（Immunoway公司，貨號：YT0099）、IgG（HRP）（Abcam公司，批號：GR3208239-1）、反轉錄試劑盒（Takara Bio公司，貨號：RR047A）、實時定量PCR染料〔SYBR qPCR Master Mix(Universal)，貨號：R01001〕。

1.4 主要儀器

Neofuge 13R高速冷凍離心機（上海力申科學儀器有限公司）、DR-200BS酶標分析儀（無錫華衛德朗一起有限公司）、光電顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司，BX53）、LBY-N6COMPACT全自動血液流變儀（北京普利生儀器有限公司）、連續波長酶標儀（美國MolecularPevices）、實 時 定 量PCR儀（ABI7500）、NanoDrop2000超微量分光光度計。

2 方法

2.1 造模

適應性喂養2天后，腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉，去除雙側卵巢。術后腹腔注射青霉素3天預防感染，取陰道分泌物涂片檢測動情周期。確認未出現動情期后進行造模，每天給予脂肪乳劑（膽固醇10 g，豬油25 g，丙基硫氧嘧啶1 g，吐溫-80 25 mL，1,2-丙二醇20 mL,膽酸鈉2 g，蒸餾水30 mL）灌胃（10 mL/kg·d）[10]，連續8周。

2.2 分組和給藥

依據前期研究，空白組與假手術組的各項指標未出現統計學差異，因此采用隨機數字表法分為空白組、模型組、西藥對照組（阿托伐他汀鈣片）、中藥對照組（珍珠靈芝片）、濟陰顆粒組，每組15只。空白組和模型組蒸餾水灌胃（10 mL·kg-1）；西藥和中藥對照組根據臨床劑量換算為大鼠劑量給予藥物灌胃干預（10 mL·kg-1）；依據前期研究結果[8,9]，濟陰顆粒中劑量（7.8 g生藥/（kg·天））與高劑量組（15.6 g生藥/（kg·天））對雌激素、卵巢衰老、冠心病心電圖、心肌酶的影響各有參差，差異不顯著，綜合考慮選擇7.8 g生藥/（kg·天）作為本次實驗干預劑量，連續8周。

2.3 標本采集和檢測方法

末次給藥后禁食、水24 h。腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈取血進行血液流變學檢測，分離血清后ELISA法檢測TC和TG；取肝臟1葉去除脂肪組織，10%多聚甲醛溶液固定，HE染色觀察肝細胞形態，免疫組織化學法檢測GPR30、MAPK、PPARγ蛋白表達；1葉-80℃保存，熒光RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA表達（表1）。

表1 基因引物信息

2.4 統計分析

3 結果

3.1 對肝臟細胞形態的影響

空白組肝細胞索放射狀分布，肝細胞結構完整、大小均勻、排列整齊。模型組肝細胞索失去正常結構、細胞呈空泡性脂肪變性，核固縮染色較深，部分凋亡或壞死，大量炎癥細胞浸潤，肝組織損傷顯著。與模型組比較濟陰顆粒組肝細胞索結構基本恢復，細胞形態比較完整（圖1）。

圖1 濟陰顆粒對肝臟細胞形態的影響（光鏡×400）

3.2 對血液流變性的影響

與空白組比較，模型組大鼠低、中、高切變率下全血粘度均顯著升高，組間差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，西藥、中藥對照組、濟陰顆粒組大鼠低、中、高切變率下全血粘度顯著降低，統計學意義顯著（P<0.01），血液流變性有不同程度改善（表2）。

表2 濟陰顆粒對血液流變性的影響（±s，n=15）

表2 濟陰顆粒對血液流變性的影響（±s，n=15）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 對血清TC、TG的影響

與空白組比較，模型組血清TC、TG水平顯著升高（P<0.01），表明血脂異常大鼠造模成功；與模型組比較，西藥、中藥對照組、濟陰顆粒組血清TC、TG水平降低，統計學差異顯著（表3）。

表3 濟陰顆粒對血清TG、TC的影響（±s，n=15）

表3 濟陰顆粒對血清TG、TC的影響（±s，n=15）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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3.4 對肝臟GPR30、PPARγ、MAPK蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組GPR30、PPARγ蛋白表達降低，MAPK蛋白表達升高，統計學差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，西藥對照組、濟陰顆粒組GPR30蛋白表達顯著升高（P<0.01），西藥對照組、濟陰顆粒組（P<0.01）、中藥對照組（P<0.05）PPARγ蛋白表達水平升高，西藥對照組、濟陰顆粒組（P<0.01）、中藥對照組（P<0.05）MAPK蛋白表達水平降低（表4、圖2~圖4）。

表4 濟陰顆粒對肝臟GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表達的影響（MOD/μm2，±s，n=6）

表4 濟陰顆粒對肝臟GPR30、PPAR-γ、MAPK蛋白表達的影響（MOD/μm2，±s，n=6）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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圖2 濟陰顆粒對肝臟GPR30蛋白表達的影響（光鏡×400）

圖4 濟陰顆粒對肝臟MAPK蛋白表達的影響（光鏡×400）

3.5 對肝臟Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組Bcl-2 mRNA表達均上調（P<0.05），調節強度相當；與空白組比較，模型組Bax mRNA表達顯著增強（P<0.01）。與模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組均可抑制Bax mRNA表達（P<0.01），調節強度相當。

4 討論

血脂異常是一類常見的代謝類疾病，與血糖升高或糖尿病有緊密聯系[11]；脂質過高與炎癥促進、頸總動脈內膜中層厚度之間呈正相關[12]，是心腦血管疾病重要風險因素。研究表明，45歲前男性TC平均水平和高膽固醇血癥患病率高于女性，而在45歲之后女性高于男性，女性絕經后高膽固醇血癥患病率增加，提示圍絕經期及絕經后是女性血脂異常防治的關鍵時期[13]，是防控冠心病、心梗、腦梗的重要階段。

圖3 濟陰顆粒對肝臟PPAR-γ蛋白表達的影響（光鏡×400）

中醫認為血脂與古代“脂”、“膏”的論述相似，歸為“痰飲”、“濕濁”、“瘀血”之類[14]。因此，臨床多以活血化瘀、祛痰除濕為主要治療手段。然而，血脂異常實為本虛標實：臟腑功能失常為本，則水液運化和疏布異常，痰濁內生，留于血脈，阻滯氣血，而成痰瘀內阻為標。腎為先天之本，主水，調節津液；肝主疏泄，調暢氣血，絕經期女性肝腎陰虛[15]，津液代謝失調，津液停聚、痰濁內蘊、陰虛失于潤澤，津枯血燥，膏脂疏布、運化障礙而不得藏，外泄于血脈則血脂異常。濟陰顆粒方中生地黃養陰生津，為君藥；淫羊藿補腎陽，強筋骨，陽生陰長為臣藥；生地黃配伍淫羊藿滋補肝腎。香附行血中之氣、疏肝解郁；丹參活血祛瘀；香附配伍丹參調氣和血。黃柏清熱燥濕為佐藥，協助君臣清虛熱，具有堅腎陰功效，合而滋補肝腎、理氣活血。現代藥理學研究：經生地黃水煎總提物干預后肝組織中泡沫細胞數量、膽固醇酯含量、膽固醇流出率明顯減少[16]；丹參涉及的生物過程包括調理血脂水平[17]，減少脂肪酸和內源性膽固醇合成[18]；淫羊藿醇提物具降血脂活性[19]，減少白色脂肪堆積；香附乙醇提取物可降低隨衰老而增長的總膽固醇、甘油三酯、LDL，VLDL[20,21]；黃柏中小檗堿可通過AMPK[22]、JNK[23]多種途徑上調LDLR的表達來降低膽固醇[24]。本研究顯示，模型組大鼠全血粘度升高，血清TC、TG升高，變化顯著，出現高血脂癥狀。經濟陰顆粒干預后，血液流變性改變減少，血清TC、TG水平降低（P<0.01），提示濟陰顆粒能夠改善血液及血清內血脂含量。

GPR30是G鈣蛋白偶聯受體又是雌激素受體，對血壓和膽固醇代謝具調節作用[25]，是心血管疾病性別特異性的決定因素，女性圍絕經期和絕經后患病的關鍵因子。GPR30激活后促使肝素結合表皮生長因子從細胞膜上釋放，使得MAPK級聯活化[26]。有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通過C/EBPβ和PPARγ調節前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化[27]。抑制MAPK信號通路可以激活PPARγ[28]。PPARγ在脂蛋白脂肪酶的作用下調整葡萄糖含量，再通過影響3-磷酸甘油進而影響TG的最終合成[29,30]；調節棕色脂肪組織促進脂肪燃燒，產生熱量[31]；增加白脂肪組織中ADP表達，活化AMPK，從而啟動脂質代謝酶的基因轉錄[32]。脂肪形成過程中MAPKs/Akt/PPARγ的降低有助于抑制脂肪細胞的分化，在脂質蓄積過程中阻斷MAPK信號通路來抑制NF-κB的激活[33]。本研究發現，與模型組比較，經濟陰顆粒干預后，大鼠肝組織中GRP30、PPARγ蛋白表達水平升高，MAPK蛋白表達明顯降低，提示濟陰顆粒對去勢雌性血脂異常大鼠的干預作用可能是通過GPR30/PPARγ/MAPK信號通路的調節來實現的。

表5 濟陰顆粒對肝臟Bcl-2，Bax mRNA表達的影響（RQ，±s，n=3）

表5 濟陰顆粒對肝臟Bcl-2，Bax mRNA表達的影響（RQ，±s，n=3）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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肝臟是脂質代謝的重要器官，肝細胞受損導致脂代謝異常，而脂肪過度積累又是導致肝代謝障礙的最重要因素。因此，肝細胞凋亡伴隨著脂代謝異常的發生發展。Bcl-2和Bax是同一家族成員，在調節細胞凋亡[34]預防肝臟病變[35]中起到重要作用，Bax可通過對線粒體的調節，促進線粒體釋放細胞色素c，推進凋亡過程，而Bcl-2的作用正相反[36]。通過HE染色觀察肝組織形態，熒光RT-PCR法檢測肝細胞凋亡因子表達，與空白組相比，模型組Bax mRNA表達升高，Bcl-2 mRNA表達降低，出現明顯的細胞丟失、空泡變性等凋亡情況，肝細胞受損嚴重。經濟陰顆粒干預后肝組織中Bax mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA表達升高，肝細胞形態好轉，提示濟陰顆粒可通過降低肝細胞凋亡進而保護肝臟。

綜上所述，濟陰顆粒能夠緩解去勢雌性血脂異常大鼠肝組織損傷，改善血脂代謝、全血粘度，降低TC、TG水平，GPR30/PPARγ/MAPK信號通路可能是其作用機制之一。也就是說，濟陰顆粒在調節絕經期綜合征，延緩卵巢衰老的同時可有效干預女性絕經后血脂異常，對女性圍絕經期和絕經后血脂異常的預防和治療具有一定意義，在女性疾病防治的關鍵時期發揮重要作用，降低女性長遠期疾病的患病風險。但本病發病機制較復雜，濟陰顆粒也可能通過其他途徑發揮作用，有待深入研究。