ULBP3聯(lián)合CEA、CA125、SCCA在肺癌中的診斷價值

牟笑，羅旋，劉佳夢，董利陽，毛朝明，汪雪峰

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 a.核醫(yī)學(xué)科，b.中心實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，以非小細(xì)胞肺癌最為常見，主要分為肺腺癌和肺鱗癌。我國每年新增肺癌患者78萬，預(yù)計到2025年，肺癌患者將達到100萬[1]。目前肺癌的發(fā)病原因尚不明確，實施對病因的一級預(yù)防比較困難，主要落實“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”的措施，而早期診斷是肺癌治療和預(yù)后的關(guān)鍵。盡管癌胚抗原(carcinogenic embryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白21-1、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、人胃泌素釋放肽前體、CA199、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌的診斷，但這些指標(biāo)仍缺乏特異性、敏感性[2-6]。探尋簡單、快速，敏感性高且特異性強的新型肺癌標(biāo)志物，對肺癌的防治工作具有重要意義。

人類巨細(xì)胞病毒糖蛋白UL-16結(jié)合蛋白(UL-16 binding protein，ULBP)是自然殺傷細(xì)胞表面重要活化受體NKG2D(natural killer group 2,member D)的配體成員之一，在許多病毒感染及胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞表面均表達上調(diào)，是一種重要的壓力誘導(dǎo)蛋白。毛朝明等[7]前期研究發(fā)現(xiàn)，ULBP3在肺癌細(xì)胞株中高表達，且以可溶性蛋白的形式存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中，提示ULBP3可能對肺癌具有診斷價值。本研究主要分析ULBP3聯(lián)合CEA、CA125、SCCA對肺癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年3月至2019年12月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理確診的106例肺癌患者(腺癌70例、鱗癌36例)作為腫瘤組，其中男72例、女34例，年齡46～83歲，中位年齡62.2歲；肺癌病理分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期76例。肺癌分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，分型依據(jù)病理檢查結(jié)果。同期選取肺部良性疾病患者56例(肺炎31例、慢性阻塞性肺疾病20例、間質(zhì)性肺炎4例、氣胸1例)作為對照組，其中男44例、女12例，年齡33～85歲，中位年齡67.1歲。肺癌組排除標(biāo)準(zhǔn)：已在外院接受手術(shù)、放化療或免疫治療者；患有其他惡性腫瘤、嚴(yán)重慢性病史。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法 采集對照組和肺癌組患者的外周血3 mL，采用低溫離心機以離心半徑12 cm，4 000 r/min離心10 min，收集血清并儲存于-80 ℃冰箱，用于集中檢測。采用美國雅培i2000型全自動化學(xué)發(fā)光儀檢測血清CEA、CA125水平，采用深圳新產(chǎn)業(yè)4000P型全自動化學(xué)發(fā)光儀檢測血清SCCA水平，并使用原裝配套試劑盒按照說明書進行操作。正常參考值：CEA<5 μg/L，CA125<35 kU/L，SCCA<2.5 μg/L。

采用時間分辨熒光免疫分析法檢測血清ULBP3水平，以商品化人ULBP3重組蛋白(ULBP3-Fc)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，設(shè)0、10、20、50、100 μg/L 5個標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，利用時間分辨熒光免疫分析方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將凍干品平衡至室溫，采用1 mL蒸餾水溶解；將所需數(shù)量的包被板條使用前平衡至室溫；將濃縮洗滌液用蒸餾水1∶25倍稀釋；將預(yù)先用Eu3+(銪)標(biāo)記好的B4-C5-D11單抗1∶200倍稀釋；按濃度由低到高在微孔板內(nèi)依次加入每孔50 μL的參考標(biāo)準(zhǔn)品，每孔再加入150 μL緩沖液，25 ℃震蕩孵育1 h，洗扳機洗滌4次，控干；每孔加入稀釋好的Eu3+標(biāo)記B4-C5-D11 200 μL，25 ℃震蕩孵育1 h，洗扳機洗滌6次，控干；每孔加增強液200 μL，注意懸空加入，避免孔間污染，25 ℃震蕩孵育5 min后用時間分辨熒光免疫分析儀測量；待測試運行結(jié)束后，退出樣本，收回所用試劑于4～8 ℃保存，所用板條取出后棄掉。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組與對照組血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平比較 肺癌組血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平高于對照組(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 兩組血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3水平比較

2.2肺癌患者血清ULBP3表達水平與臨床特征的關(guān)系 不同性別、年齡、病理類型、臨床分期及有無吸煙史的肺癌患者血清ULBP3水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 肺癌患者血清ULBP3表達水平與臨床特征的關(guān)系

2.3血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3對肺癌的診斷價值 ROC曲線結(jié)果顯示，ULBP3聯(lián)合CEA、CA125、SCCA檢測的曲線下面積(area under the curve，AUC)大于各指標(biāo)單獨檢測，見圖1。ULBP3聯(lián)合CEA、CA125、SCCA診斷肺癌的靈敏度和特異度均高于各指標(biāo)單獨檢測，見表3。

CEA：癌胚抗原；CA125：糖類抗原125；SCCA：鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原；ULBP3：UL-16結(jié)合蛋白3；ROC：受試者工作特征曲線

表3 血清CEA、CA125、SCCA、ULBP3對肺癌的診斷效能評價

2.4血清CEA、CA125、ULBP3對肺腺癌的診斷價值 ROC曲線結(jié)果顯示，ULBP3聯(lián)合CEA、CA125檢測的AUC大于各指標(biāo)單獨檢測或兩兩聯(lián)合檢測,見圖2。ULBP3聯(lián)合CEA、CA125診斷肺腺癌的靈敏度和特異度大于各指標(biāo)單獨檢測和兩兩聯(lián)合檢測，見表4。

CEA：癌胚抗原；CA125：糖類抗原125；ULBP3：UL-16結(jié)合蛋白3；ROC：受試者工作特征曲線

表4 血清SCCA、CEA、ULBP3對肺腺癌的診斷效能評價

2.5血清SCCA、ULBP3對肺鱗癌的診斷價值 ROC曲線結(jié)果顯示，ULBP3聯(lián)合SCCA檢測的AUC大于各指標(biāo)單獨檢測，見圖3。ULBP3聯(lián)合SCCA診斷肺鱗癌的靈敏度和特異度高于各指標(biāo)單獨檢測，見表5。

SCCA：鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原；ULBP3：UL-16結(jié)合蛋白3；ROC：受試者工作特征曲線

表5 血清SCCA、ULBP3對肺鱗癌的診斷效能評價

3 討 論

肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等。與其他類型肺癌相比，以腺癌和鱗癌為主的非小細(xì)胞肺癌占80%以上，生長和轉(zhuǎn)移擴散較慢，不易早期發(fā)現(xiàn)，其治療主要以手術(shù)結(jié)合放化療為主的綜合治療模式[9]。

CEA是一種細(xì)胞表面糖蛋白，與結(jié)腸癌等胚層組織癌細(xì)胞密切相關(guān)，肺癌患者血清CEA水平升高，檢測血清中的CEA水平對肺癌的早期診斷、治療效果評價、預(yù)后評估等具有一定的臨床價值。有研究表明，肺癌、胃癌、乳腺癌等患者血清CEA水平升高，且CEA在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達水平顯著高于健康對照組[10]，本研究結(jié)果與上述研究一致。CA125是一種糖蛋白復(fù)合物，在卵巢癌患者血清中水平升高，在肺癌導(dǎo)致的惡性胸腔積液中高表達，也是肺癌輔助診斷的常用組合指標(biāo)之一[11]。SCCA是從鱗狀上皮細(xì)胞來源的癌組織細(xì)胞中提取到的抗原物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)SCCA在肺鱗癌中的表達水平顯著高于健康對照組[12]。ULBP蛋白在許多病毒感染和惡性腫瘤細(xì)胞表面均表達上調(diào)，且在腸癌、肺癌、卵巢癌等癌細(xì)胞中表達[13-15]。

Mou等[16]前期研究發(fā)現(xiàn)，ULBP3在結(jié)腸癌、肺癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞系中高表達，在胃癌、肺癌、食管癌患者血清中高表達，本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果一致。中華醫(yī)學(xué)會肺癌臨床診療指南建議中提出，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可提高腫瘤診斷的靈敏度和特異度[17]。本研究ROC曲線結(jié)果顯示，ULBP3聯(lián)合CEA、CA125、SCCA檢測診斷肺癌的靈敏度和特異度高于各指標(biāo)單獨檢測；ULBP3聯(lián)合CEA、CA125檢測診斷肺腺癌的靈敏度和特異度高于各指標(biāo)單獨檢測。本研究結(jié)果顯示，ULBP3診斷肺腺癌的靈敏度高于CEA，可能與本研究的檢測方法有關(guān)，后續(xù)研究應(yīng)建立基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)原理的檢測體系，與時間分辨免疫熒光分析法進行比較，進一步驗證本研究的結(jié)論。Holdenrieder等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SCCA能夠鑒別健康人群、良性疾病和小細(xì)胞肺癌。血清SCCA水平升高提示非小細(xì)胞肺癌的可能性較大，特別是肺鱗癌，對于肺癌患者，SCCA聯(lián)合其他生物標(biāo)志物可提高診斷效能。本研究結(jié)果顯示，ULBP3聯(lián)合SCCA檢測診斷肺鱗癌的靈敏度和特異度均高于SCCA單獨檢測。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ULBP1對胰腺癌的早期診斷有重要價值，ULBP2可以作為評估胰腺癌患者風(fēng)險的指標(biāo)。Yamaguchi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，游離型ULBP2是肺鱗癌的重要診斷標(biāo)志物，可以作為進展型非小細(xì)胞肺癌的預(yù)測指標(biāo)，本研究結(jié)果與上述研究基本一致。ULBP3與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測能夠顯著提高肺癌診斷的特異性和敏感性，因此ULBP3有望成為肺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。

NKG2D配體家族成員ULBP蛋白在多種腫瘤中高表達，并以游離形式存在于腫瘤患者血清中，可通過調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Osterburg等[21]研究發(fā)現(xiàn)在肺淋巴管平滑肌瘤病中，血清中游離ULBP2和ULBP3的含量增多，且與肺功能加速下降相關(guān)。游離形式的ULBP蛋白增多一方面是由于基質(zhì)金屬蛋白酶或磷脂酶C的溶蛋白性裂解作用所致，另一方面是通過溶酶體依賴的方式釋放到胞外導(dǎo)致。而游離ULBP蛋白能夠結(jié)合到自然殺傷細(xì)胞表面的NKG2D受體上，通過影響自然殺傷細(xì)胞受體的功能而影響其殺傷作用[22-23]。Guo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌患者中，γ干擾素能夠通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的合成促進膜表面ULBP3分子脫落，通過增加循環(huán)中游離ULBP3的含量抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷功能。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布通過抑制環(huán)加氧酶2上調(diào)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460細(xì)胞表面ULBP1-3的表達，進而增加癌細(xì)胞對自然殺傷細(xì)胞的敏感性。因此，ULBP蛋白在腫瘤細(xì)胞膜表面的表達水平和游離形式的ULBP3含量可以影響自然殺傷細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的殺傷活性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但游離形式的ULBP蛋白家族成員在各種腫瘤中的表達情況尚不明確。

綜上所述，ULBP3作為新型標(biāo)志物參與傳統(tǒng)項目聯(lián)合診斷，大大提高了肺癌的診斷效能。血清ULBP3有望作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物，但肺癌的明確診斷仍需要病理學(xué)依據(jù)。另外，本研究的樣本量偏少，可能對結(jié)果產(chǎn)生影響，需要進一步大樣本研究的證實。