吳茱萸堿衍生物的合成及其抗腫瘤活性

萬成穎，余文穎，孔令義（通訊作者）

（中國(guó)藥科大學(xué)<江蘇省天然產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天然藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室> 江蘇 南京 210009）

吳茱萸堿是從蕓香科植物吳茱萸的果實(shí)中分離得到的一種喹唑啉類生物堿，具有抗炎，抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性[1]。隨著近年來吳茱萸堿的抗腫瘤機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase,Topo）活性位點(diǎn)結(jié)合抑制Topo 活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和遷移[2]。組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一類表觀遺傳酶，能調(diào)節(jié)多種組蛋白和非組蛋白的乙酰化，控制基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞增殖、遷移、死亡和血管生成[3]。HDAC 在癌細(xì)胞中高表達(dá)，被認(rèn)為是癌癥治療的重要分子靶點(diǎn)[4]。HDAC 與許多癌基因和腫瘤抑制因子相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1 和HDAC2 與Topo 高度相關(guān)，2 種酶之間存在一個(gè)功能耦合的復(fù)合物，能在體內(nèi)相互作用[5]。近年來，HDAC 和Topo 的雙靶點(diǎn)抑制劑受到廣泛關(guān)注，HDAC 抑制劑與Topo 抑制劑的協(xié)同作用有望減少腫瘤耐藥性，顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性[6]。本研究報(bào)道了一類基于HDAC 特異性抑制劑伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑吳茱萸堿的雙重抑制劑，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了探討，報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

所有溶劑和試劑均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商，無需進(jìn)一步純化即可使用。硅膠GF254 板，100-200 目硅膠（青島海洋化工）；ACF-500 MHz 型磁共振儀（美國(guó)Bruker 公司）；Melting Point B545 熔點(diǎn)儀（瑞士BUCHI 公司）；安捷倫HP1100 型質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）。BD Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國(guó)碧迪公司）。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 方法

（1）合成方法：中間化合物1 ～4 的合成。取吳茱萸堿（3.0 g，1 mmol）溶解于二甲基甲酰胺溶液（15 mL）中，加入鈉氫（0.35 g，1.5 mmol），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 min后加入5-溴戊酸甲酯（1.92 g，1 mmol），緩慢升溫至80℃，再反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加水（30 mL）淬滅。用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層。采用柱層析法分離純化，得 到5-（14- 甲 基-5- 氧 代-7,8,13b，14- 四 氫 吲 哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）戊酸甲酯，為中間化合物1。同法制備得到6-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酸酯（中間化合物2）、7-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）庚酸甲酯（中間化合物3）、8-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶基[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）辛酸甲酯（中間化合物4）。

目標(biāo)化合物Ev4C-Ev7C 的合成。取鹽酸羥胺（4.67 g，67 mmol）溶解在甲醇溶液（25 mL）中，在冰浴攪拌下滴加含有氫氧化鉀（5.61 g，100 mmol）的甲醇溶液（12 mL），在冰浴中反應(yīng)30 min。過濾沉淀物，得到濾液，為羥胺甲醇溶液。然后，將化合物1（0.048 g，0.11 mmol）溶解在上述新制備的羥胺甲醇溶液（15 mL）中。在室溫下攪拌反應(yīng)45 min，然后用乙酸調(diào)節(jié)至pH7。將混合物濃縮，殘留物用水洗滌，得到N-羥基-5-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）戊酰胺，命名為Ev4C。同法制備得到化合物N-羥基-6-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酰胺（Ev5C）、N-羥基-7-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）庚酰胺（Ev6C）和N-羥基-8-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酰胺（Ev7C），均為黃色固體。

（2）細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)：將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種在96 孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。加入測(cè)試化合物孵育24 h 后，向每個(gè)孔中加入含3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide, MTT）的培養(yǎng)基，再孵育4 h。棄去MTT，加入二甲基亞砜混勻。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光值，通過Logit法測(cè)定引起50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的濃度。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次。

（3）細(xì)胞凋亡分析：將HT29細(xì)胞以5×105/孔的密度接種在6 孔板中，用濃度為5μM 的化合物處理24 h或48 h。然后消化收集細(xì)胞，用磷酸緩沖溶液洗滌2 次后離心除去上清液，按照Annexin-V-FITC 凋亡試劑盒進(jìn)行染色，后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次。

（4）細(xì)胞內(nèi)活性氧水平分析：將HT29 細(xì)胞以5×105/孔的密度接種在6 孔板中，用不同濃度的化合物處理24 h。然后消化收集細(xì)胞，用磷酸緩沖溶液洗滌2 次后離心除去上清液，之后按照活性氧檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行處理。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光（λEx=488 nm,λEm=525 nm）。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次。

2.結(jié)果

2.1 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

4 個(gè)目標(biāo)化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 2 種癌細(xì)胞系呈現(xiàn)中等至良好的抑制作用，而對(duì)人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM-460 的抑制作用偏弱。此外，Ev6C 顯示出最優(yōu)的抗腫瘤活性，比SAHA 和吳茱萸堿活性更高，且提高了安全性，顯示出雙靶點(diǎn)抑制劑的優(yōu)越性。此外，亞甲基鏈的長(zhǎng)度的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性的提高，這可能與抗HDAC 活性相關(guān)[7]，見表1。

表1 化合物Ev4C-Ev7C 細(xì)胞毒活性檢測(cè)

2.2 細(xì)胞凋亡分析

接著我們進(jìn)行了凋亡檢測(cè)，進(jìn)一步評(píng)估目標(biāo)化合物的抗腫瘤機(jī)制。結(jié)果顯示，化合物Ev6C 在HT29 細(xì)胞系中呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的促凋亡活性，孵育24 h 和48 h 后細(xì)胞總凋亡率分別為25.04%和57.30%（Annexin Ⅴ+-PI-和Annexin Ⅴ+-PI+象限的細(xì)胞總數(shù)），凋亡水平明顯高于SAHA（21.34%和34.80%）和吳茱萸堿（16.01%和46.40%），說明化合物Ev6C 通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶和HDAC在細(xì)胞水平上發(fā)揮協(xié)同作用。

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平分析

越來越多的證據(jù)表明，過量的活性氧水平與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。隨后，我們?cè)u(píng)估了Ev6C 對(duì)HT29 細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，Ev6C 孵育后，HT29 細(xì)胞的活性氧水平顯著增加，分別在2、2.5 和10μM 時(shí)增加1.58、2.59、5.25 倍。Ev6C 劑量依賴性刺激活性氧的表達(dá)。

3.討論

作為吳茱萸的有效成分，吳茱萸堿對(duì)多種癌細(xì)胞具有顯著的抗增殖作用，是優(yōu)選的先導(dǎo)化合物[9]。基于拓?fù)洚悩?gòu)酶和HDAC 之間的潛在生物聯(lián)系，拓?fù)洚悩?gòu)酶和HDAC 抑制劑能發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[10]。我們合理地設(shè)計(jì)并合成了一系列吳茱萸堿衍生物。值得注意的是，化合物Ev6C 作為Topo/HDAC 的有效抑制劑，顯示出良好的抗增殖活性和安全性。進(jìn)一步分析了化合物Ev6C 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生的情況，結(jié)果顯示癌細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的凋亡效應(yīng)，且活性氧水平顯著提高，并呈劑量依賴性增加。兩者顯示化合物Ev6C 抗腫瘤機(jī)制之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，相比單個(gè)拓?fù)洚悩?gòu)酶或HDAC 抑制劑，化合物Ev6C 具有更好的抗腫瘤活性，具有近一步的研究?jī)r(jià)值。