不同處理對牛枝子種子萌發和宿存萼片的影響

馬鵬程， 謝全剛， 趙 祥， 董其軍， 張吉宇*

(1.草地農業生態系統國家重點實驗室； 蘭州大學草地農業科技學院， 甘肅 蘭州 730020； 2. 河西學院農業與生態工程學院，甘肅 張掖 734000； 3. 山西農業大學草業學院， 山西 太谷 030801； 4. 酒泉市未來草業有限責任公司， 甘肅 酒泉 735000)

牛枝子(LespedezapotaniniiVass.)為豆科胡枝子屬多年生牧草，生長于荒漠草原、草原帶的沙質地、礫質地、丘陵地、石質山坡及山麓[1-2]。自2003年起，蘭州大學草地農業科技學院在內蒙古阿拉善盟，發現豆科牛枝子作為少有的優良牧草，在年降水量為120 mm的荒漠草原生長良好，因而開展了馴化選育，以產量性狀和抗旱性為選育目標，在內蒙古阿拉善盟和甘肅榆中經過連續多年的栽培馴化[3]，2021年經甘肅省草品種審定委員會審定為新品種‘騰格里’牛枝子(審定編號：GS-CWV-2020-007)，該品種具有抗旱、抗寒和耐瘠薄的特點，適宜于我國北方干旱半干旱、年降雨量為100～400 mm的地區和黃土高原半農半牧區，為荒漠草原補播、干旱地區植被恢復、人工草地建植的優良豆科牧草。‘騰格里’牛枝子可與‘騰格里’無芒隱子草(Cleistogenessongorica)混播，構建荒漠草原、沙漠化防治與治理的鄉土草種“禾本科+豆科”混播生態系統，為脆弱生態區提高生產力和生態服務功能提供案例。但是由于牛枝子種子緊緊包裹于宿存萼片中，并且種子硬實率很高，致使種子脫粒難度大和田間出苗率差，嚴重制約了該品種的規模化生產和推廣利用。

硬實是植物中普遍存在的現象，硬實種子是由于種皮(有時也包括果皮)堅硬而很難進行吸脹萌發的種子，廣泛存在于豆科、茄科、旋花科、錦葵科等多種植物中[4-5]。硬實有利也有弊，一方面有利于抵抗逆境、收獲和貯藏，另一方面不利于建植與雜草防治和種子檢驗與加工[6-7]。但在農業生產中，有效的破除硬實，促進種子萌發，對于成功建植至關重要[8]。大量研究表明，牧草硬實種子可以通過物理處理方法和化學處理方法有效的破除，如紫花苜蓿(Medicagosativa)、達烏里胡枝子(Lespedezadavurica)、雞峰黃芪(Astragaluskifonsanicus)和黃芪(Astragalusmembranaceus)等種子可以用不同的方法破除硬實[9-14]。種子收獲是決定種子生產成敗的關鍵環節，而種子的脫粒是種子收獲的主要內容之一[15]。有研究表明，苜蓿和三葉草(Trifolium)等豆科牧草可以采用木刀種子脫粒機進行脫粒，對種子的損傷小，種子質量較好[16]。牛枝子種子硬實率高達96.00%左右，且宿存萼片在種子成熟后不會自然脫落，會緊緊附著在種子表面，這給種子萌發和脫粒帶來困難，針對這種特性，實際生產中應重點解決脫粒和硬實破除的技術問題。但對于牛枝子種子硬實破除和脫粒的研究鮮有報道。因此，本研究通過研究不同處理對牛枝子宿存萼片和種子硬實的影響，旨在明確牛枝子去除宿存萼片和破除硬實的方法，為‘騰格里’牛枝子的推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料為于2020年10月在甘肅張掖甘州區收獲的蘭州大學所培育的‘騰格里’牛枝子種子。

1.2 試驗設計

1.2.1宿存萼片去除 濃硫酸處理：將100粒帶有宿存萼片種子分別置于盛有10 mL 98%的濃硫酸中，用玻璃棒小心攪拌使種子完全浸沒，分別處理0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 min，取出后自來水沖洗3 min，每個處理重復3次。

種子破皮機處理：將100粒帶有宿存萼片種子用種子破皮機進行處理1～10遍，每個處理重復3次。

1.2.2硬實破除 種子破皮機處理：用種子破皮機(湖南農友機械有限公司，6 NF-4振動篩單米機改造而來)處理一定量去除宿存萼片種子1～10遍，每個處理重復3次，對照(CK)為不做任何處理，下同。

濃硫酸處理：將一定量去除宿存萼片種子分別置于盛有10 mL 98%的濃硫酸中，用玻璃棒小心攪拌使種子完全浸沒，分別處理0，5，10，15，20，25，30 min，取出后自來水沖洗3 min。

熱水處理：分別用70，80，90，97℃(沸水)熱水處理一定量去除宿存萼片種子至水自然冷卻，將種子取出備用。

高溫處理：將一定量去除宿存萼片種子放在80，90，100℃恒溫干燥箱中分別處理0.5，1.0，1.5，2.0 h。

液氮處理：用液氮處理一定量去除宿存萼片種子3，5，10 min。

1.2.3發芽試驗 參考國家標準《草種子檢驗規程發芽試驗》(GB/T 2930.4-2017)[17]，將處理后的種子各取100粒，用培養皿紙上發芽的方法(TP法)，于25℃下進行發芽，光照/黑暗為12 h/12 h，發芽天數為14 d，設置3個重復，濾紙為90 mm定性濾紙，第7 d計算發芽勢，14 d計算發芽率。

1.3 測定指標及方法

根據記錄的經過種子破皮機處理后去除宿存萼片數、破碎數、種子發芽數、幼苗鮮重，計算牛枝子宿存萼片去除率、種子破碎率、發芽率、發芽勢、發芽指數與活力指數等指標，采用以下公式進行計算[18-19]：

宿存萼片去除率=去除宿存萼片完整的種子數/供試種子數×100%

破碎率=破碎種子數/供試種子數×100%

發芽勢=第5 d正常發芽種子數/供試種子數×100%

發芽率=第14 d正常發芽種子數/供試種子數×100%

發芽指數=Σ(Gt/Dt)

活力指數=Σ(Gt/Dt)×S

式中：Gt為不同時間的發芽數，Dt為相應發芽日數，S為第10 d每株平均鮮重。

1.4 數據分析

數據統計和制圖分別由Microsoft Excel 2010完成，并用IBM SPSS statistics19.0進行單因素試驗方差分析，并用LSD法對各項指標進行多重比較(P< 0.05)，數據均以“均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 種子破皮機和濃硫酸對牛枝子宿存萼片去除的影響

種子破皮機處理對牛枝子宿存萼片去除具有顯著影響(P<0.05)(圖1a)。隨著種子破皮機處理遍數的增加，宿存萼片的去除率先升高后不變，在處理第4遍時去除率達到100%。濃硫酸處理對牛枝子宿存萼片的去除也具有顯著影響(P<0.05)(圖1b)。隨著濃硫酸處理時間的增加，宿存萼片的去除率先升高后不變，在12 min及之后處理去除率均達到100%。

圖1 種子破皮機和濃硫酸處理對牛枝子宿存萼片的影響Fig.1 Effect of the seed coat breaking machine and concentrated sulfuric acid treatments on the persistent sepals of Lespedeza potaninii Vass注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。A為種子破皮機處理；B為濃硫酸處理Note:Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level,the same as below. A,the seed coat breaking machine treatments;B,concentrated sulfuric acid treatments

2.2 種子破皮機對牛枝子發芽的影響

種子破皮機對牛枝子種子發芽具有顯著影響(P<0.05)(表1)。種子破皮機處理過程中，種子會存在破碎的現象，隨著處理遍數的增加，破碎率一直增大，在10遍時最大，為8.00%，與8和9遍無顯著差異；硬實率隨處理遍數增加顯著下降(P<0.05)，在10遍時最小(24.33%)，與CK(96.67%)差異顯著(P<0.05)，與9遍時無顯著差異；發芽勢、發芽率和發芽指數隨處理遍數增加呈先升高后下降趨勢，均在9遍時達到最大，分別為61.67%，66.33%和33.14；活力指數也呈先升高后下降趨勢，在處理8遍最大，為0.87，并與9遍時無顯著差異。結果表明種子破皮機對打破牛枝子種子休眠和萌發具有較好的效果，并在處理9遍時效果最佳。

表1 種子破皮機處理對牛枝子種子發芽的影響Table 1 Effects of different the seed coat breaking machine treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.3 濃硫酸處理對牛枝子種子發芽的影響

濃硫酸處理對牛枝子種子的發芽具有顯著影響(P<0.05)(表2)。牛枝子種子硬實率非常高，濃硫酸處理顯著降低硬實率(P<0.05)，處理30 min時硬實率最低(13.33%)。隨著濃硫酸處理時間增加，發芽勢和發芽率呈增大趨勢，在30 min時達到最大，分別為80.00%和84.00%，并與20 min和25 min處理無顯著差異；發芽指數呈增大趨勢，在30 min時最大，為38.73，與20 min處理無顯著差異；活力指數呈先升高后下降的趨勢，在25 min時最大，為1.14，與20 min和30 min無顯著差異。結果表明，濃硫酸處理可以有效的破除牛枝子種子硬實，提高發芽率和發芽勢等，處理20～30 min均可。

表2 濃硫酸處理對牛枝子種子發芽的影響Table 2 Effects of sulfuric acid treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.4 高溫干燥處理對牛枝子種子發芽的影響

高溫干燥處理對牛枝子種子發芽有一定的影響(表3)。80℃和90℃處理對牛枝子種子硬實破除和促進發芽的效果不明顯。在100℃時，隨著處理時間增加，硬實率呈一直下降的趨勢，在100℃處理2 h時硬實率最低，為36.00%，與CK差異顯著(P<0.05)；發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數均呈先升高后下降的趨勢，在100℃處理1.5 h時均達到最大值，分別為32.67%，35.33%，21.75和0.47。

表3 高溫干燥處理對牛枝子種子發芽的影響Table 3 Effects of high temperature treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

2.5 熱水和液氮處理對牛枝子種子發芽的影響

熱水和液氮處理對牛枝子種子發芽具有一定的影響(表4，5)。隨著水溫度的升高，硬實率呈下降趨勢，在97℃處理時硬實率最低，與CK差異顯著(P<0.05)；發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數均先上升后下降，在90℃的熱水處理下均達到最大值，分別是22.67%，38.00%，12.19和0.42。相比CK，液氮處理顯著降低了牛枝子硬實率，提高了發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數(P<0.05)，但發芽率最高僅16.67%，且處理時間對硬實破除效果沒有顯著影響。

表4 不同熱水處理對牛枝子種子發芽的影響Table 4 Effects of different hot water treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

表5 不同液氮處理對牛枝子種子發芽的影響Table 5 Effects of different liquid nitrogen treatments on seed germination of Lespedeza potaninii Vass

3 討論

3.1 不同的處理對去除牛枝子宿存萼片的影響

牛枝子的宿存萼片在種子成熟時不會自然脫落，附著在種子表面，給種子脫粒帶來困難。本研究研究表明，種子破皮機對牛枝子宿存萼片去除效果顯著，在處理4遍時，去除率可達到100%。這與余殿友[20]研究結果一致，胡枝子(LespedezabicolorTurcz)種子可以采用種子破皮機去除宿存萼片，同時也可將種子打磨以便降低硬實率，提高種子的發芽率。濃硫酸雖然對于牛枝子宿存萼片去除具有顯著效果，但在大規模的生產中具有一定的危險性，不宜采用，種子破皮機相對比較安全且經濟，所以在生產過程宜采用種子破皮機去除宿存萼片。

3.2 不同的處理對牛枝子萌發的影響

打破種子硬實的方法很多，但是對于不同的物種，各種方法處理效果不盡相同。機械破除硬實更容易實現商業化[21]，且更為有效和安全；機械處理通過損傷硬實種皮，增強透性，迅速解除機械限制作用而促使種子萌發[22]。牛枝子作為一種抗旱優良豆科牧草，在畜牧業和生態恢復方面發揮著重要作用，但種子硬實率高達96.00%左右，若不能解決牛枝子種子硬實問題，則無法推廣種植，因此急需一種安全經濟的牛枝子種子硬實破除技術。許多研究表明，機械法可以有效破除田菁(Sesbaniacannabina)、紫云英(AstragaluscicerL.)、草木樨狀黃芪種子(Astragalusmelilotoides)和野豌豆(ViciaamoeaFisch)等種子硬實，提高發芽率等，可以作為破除硬實的首選方法[23-26]。這與本研究試驗結果一致，種子破皮機處理牛枝子種子可以顯著降低牛枝子的硬實率，從96.67%降低至24.33%；發芽率從2.67%提高到66.33%；并且提高了發芽勢、發芽指數和活力指數，在處理9遍時效果最佳；而且本研究創新性使用種子破皮機不僅大幅降低牛枝子種子硬實率，發芽率也超過60.00%，還可以有效的去除宿存萼片，且操作簡單安全，可在生產實踐中推廣，這為‘騰格里’牛枝子種子擴繁和推廣奠定了基礎。

濃硫酸等強酸處理可以腐蝕局部種皮，打破柵欄組織的屏障，使種殼薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大種皮的透性[27]。濃硫酸對大多數種子硬實破除是最有效的方法，但是也存在一些問題：如處理時間的較難控制，特別是對于種皮較薄的種子，如果處理時間過長，就會損傷種子；處理后的沖洗要徹底，不然易造成酸害等[22]。有研究表明，濃硫酸可以降低紫花苜蓿、黃芪、達烏里胡枝子、多花木藍(Indigoferaamblyantha)、二色胡枝子(Lespedezabicolor)和山野豌豆等種子硬實率，提高發芽率，并在所有處理效果最佳[28-32]。與本試驗的結果表明相似，濃硫酸浸種20～30 min發芽率均最高，都在80%以上，硬實率大大降低，在所有處理中效果最佳，但濃硫酸是嚴格控制使用的化學藥品，在使用過程中操作不當會造成嚴重的后果，所以在大規模生產過程中一般不建議用濃硫酸破除硬實。

高溫處理可用高溫干燥處理和溫水浸泡處理。某些牧草種子經過高溫干燥處理后，種皮龜裂為疏松多縫的狀態，改善了種子的氣體交換條件，從而解除由種皮造成的休眠，促進萌發[22]。有研究表明，將銀合歡(Leucaenaleucocephala)用80℃高溫干燥10 min，發芽率效果較差，僅為19.3%[33]；本研究結果表明，高溫干燥處理，溫度過低和時間較短時，硬實破除效果不佳，但溫度過高和時間較長，雖硬實率降至36.00%，但發芽率最高也僅為32.37%，導致這種現象的原因是處理溫度過高和時間過長會導致種子的死亡，從而導致發芽率較低。但也有研究表明，高溫干燥處理可以有效降低黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)和無芒隱子草等種子硬實率，提高發芽率[34-35]。這說明不同物種高溫干燥處理的效果不同，應根據物種進行選擇。Wang等[36-37]用熱水處理5種野生豇豆(Vigna)，研究表明80℃熱水浸種是適宜的浸種溫度，溫度過低破除休眠效果較差，而溫度過高會傷害種子使不正常和死種子增加，適宜浸種時間為3～6 min。鄭天翔等[38]用不同溫度的水處理黃芪種子可以提高種子的發芽率和發芽勢但效果不明顯。這與本試驗結果一致，在熱水(90℃)是發芽率最高，僅為38.00%，可能的原因與高溫干燥處理相同，這也說明這兩種方法不宜作為牛枝子種子破除硬實的首選。

液氮處理亦可破除種子休眠。本研究表明，液氮處理雖可以降低硬實率，但發芽率僅為15%左右，效果不佳。與前人在達烏里胡枝子、多花木藍和二色胡枝子[28-29]結果一致。也有研究表明，用液氮處理苜蓿20 min后，硬實幾乎全部破除[39]，說明液氮處理對于不同物種效果存在差異。

4 結論

本試驗研究發現，種子破皮機在處理4遍時，牛枝子宿存萼片完全除去，將種子處理9遍時，在破碎率較低的情況下，顯著降低了種子硬實率，提高了發芽勢和發芽率等，發芽率達66.33%，且操作簡單和安全，可作為大規模生產條件下的‘騰格里’牛枝子去除宿存萼片和硬實破除適宜技術進行推廣。