芥子油苷對(duì)豌豆蚜生長、存活及保護(hù)酶的影響

王文軍, 劉 磊, 朱碧鋒, 王成之, 王含笑, 馬云錫, 魏江文, 王森山

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070)

苜蓿蚜(Aphiscraccivora)、豌豆蚜(豆無網(wǎng)長管蚜，Acyrthosiphonpisum)和苜蓿斑蚜(Therioaphismaculata)是危害我國苜蓿生長(MedicagosativaL.)較為嚴(yán)重的3種蚜蟲[1-3]。豌豆蚜具有發(fā)育歷期較短、世代重疊嚴(yán)重、體形微小、取食隱蔽等特點(diǎn)。大量使用化學(xué)農(nóng)藥難以對(duì)豌豆蚜取得理想的控制效果，而且容易引起殘留(Residue)、抗性(Resistance)和再度猖獗(Resurgence)3R問題及食品安全問題[4]。豌豆蚜在國內(nèi)有綠色型和紅色型2種顏色的生物型[5]，綠色型在我國發(fā)現(xiàn)歷史久遠(yuǎn)，分布較廣，對(duì)它的研究也較多[6]。紅色型在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)晚，對(duì)它的發(fā)生規(guī)律、危害機(jī)理及防治措施等缺乏研究，若一旦爆發(fā)，將容易成災(zāi)[7-8]。因此，對(duì)豌豆蚜的防治研究引起廣大學(xué)者的重視。

芥子油苷(Glucosinolate biosynthesis，GS)為β-硫代葡萄糖苷N-羥硫酸鹽，是存在于十字花科植物中的一類重要的次生代謝物[9]。芥子油苷與其降解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，如參與植物防衛(wèi)反應(yīng)、抑制昆蟲取食[10]。李鮮等[11]研究了十字花科植物硫苷的分布、生化特性、酶促水解產(chǎn)物的形成和生理活性等，結(jié)果表明，硫苷酶促水解產(chǎn)物可以有效地預(yù)防昆蟲的侵害。Kliebenstein等人研究表明，桃蚜(Myzuspersicae)取食擬南芥后，將會(huì)誘導(dǎo)芥子油苷的產(chǎn)生；且芥子油苷能抑制桃蚜對(duì)擬南芥的取食[12]。

本文將對(duì)芥子油苷對(duì)豌豆蚜生長、存活及保護(hù)酶的影響這一關(guān)鍵問題展開研究，通過在人工飼料中添加不同濃度芥子油苷飼喂豌豆蚜，觀察芥子油苷對(duì)豌豆蚜的生長發(fā)育的影響，測(cè)定飼喂后豌豆蚜的存活率、有翅蚜率、相對(duì)日均體重增長率及保護(hù)酶活性指標(biāo)等，明確芥子油苷對(duì)豌豆蚜生長發(fā)育及體內(nèi)保護(hù)酶的影響，以期為芥子油苷抗豌豆蚜的生化機(jī)理提供理論依據(jù)，也為開發(fā)藥用植物資源、尋找新的植物源殺蟲劑理論研究與實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試植物材料 蠶豆(ViciafabaL.)播種于育苗杯(寬：5 cm，高：8 cm；基質(zhì)為土壤∶草炭∶蛭石=3∶2∶1)中育苗，后置于人工氣候箱中培養(yǎng)(溫度:24℃，相對(duì)濕度:70%，光照:16 h∶8 h)。育苗50杯，每杯保苗3株，挑選生長發(fā)育一致的4葉期蠶豆植株接蚜供試。

1.1.2供試蟲源 豌豆蚜由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供；供試豌豆蚜在室內(nèi)盆栽蠶豆上飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件與育苗的條件一致。挑選成蟲在離體葉片飼養(yǎng)12 h，待產(chǎn)蚜后剔除成蚜，選用初產(chǎn)2齡若蚜，用于人工飼料飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1豌豆蚜飼養(yǎng)方法 不同濃度芥子油苷的人工飼料配制，參照葉超[20]和路康等[21]人的飼養(yǎng)方法。含芥子油苷人工飼料由磷酸三鉀、礦物質(zhì)、維生素、蔗糖化合物及氨基酸(天津凱信化工公司)加入不同濃度的芥子油苷(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，且芥子油苷為純度99%的植物提取物)組成。

養(yǎng)蟲籠以有機(jī)雙通管為主體(寬:2.5 cm，高:3 cm)，一端用封口膜封住，添加配制好的飼料100 μL，然后再封一層石臘膜，另一端不封。然后在雙通管內(nèi)部有飼料一端接上蚜蟲，待穩(wěn)定取食后進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)過程中，養(yǎng)蟲籠無封口膜的一端朝下，有封口膜的一端朝上，并放在SPX-300型光照培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)中飼養(yǎng)及觀察(圖1)。

圖1 人工飼料飼喂裝置Fig.1 Arificial diet feeding site setup

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)十字花科植物中芥子油苷含量為1.87 μmol·g-1[22]，本研究設(shè)置芥子油苷濃度為0 μmol·g-1(CK)，0.94 μmol·g-1(A1)，1.87 μmol·g-1(A2)和為2.86 μmol·g-1(A3)4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)30頭蚜蟲，測(cè)定初產(chǎn)2齡若蚜豌豆蚜的存活率、產(chǎn)蚜量及相對(duì)日均體重增長率。將在豌豆蚜取食6 d，12 d和20 d測(cè)定存活率。

1.2.3不同濃度芥子油苷對(duì)豌豆蚜保護(hù)酶活性的分析 接種處理及樣品采集：將不同濃度芥子油苷添加于人工飼料，豌豆蚜取食0 d(CK)，1 d，2 d和3 d，每個(gè)處理收集100頭。各處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共取樣4組。挑取的豌豆蚜經(jīng)液氮處理后保存于-80℃以備酶活性測(cè)定。

[11]胡疊：《京劇的創(chuàng)新傳統(tǒng)與當(dāng)代立場(chǎng)》，《中國戲曲學(xué)院.京劇與現(xiàn)代中國社會(huì)——第三屆京劇學(xué)國際學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集》，中國戲曲學(xué)院，2009年，第7頁.

酶液提取：SOD，POD和CAT活性測(cè)定參考袁偉寧[23]，并略加改進(jìn)。取10頭豌豆蚜稱重，置于預(yù)冷的試管中，加入1 mL 50 mmol·L-1pH值7.8的預(yù)冷磷酸緩沖液。在冰塊上研磨成勻漿后，于高速冷凍離心機(jī)4℃，10 000 g下離心10 min，上清液即為提取酶液，用于SOD，POD，CAT活性及可溶性蛋白總量測(cè)定。

1.2.4豌豆蚜可溶性蛋白總量測(cè)定 可溶性蛋白總量測(cè)定參考BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒，酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，Inc)預(yù)熱30 min，調(diào)到波長562 m，蒸餾水調(diào)零[24]。具體步驟如下：

a．配置BCA工作液，根據(jù)樣本數(shù)量計(jì)算BCA工作液所需總量，將試劑A(試劑A：1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉和0.16%酒石酸鈉等物質(zhì)，混合調(diào)pH值至11.25)和試劑B(試劑B：2%硫酸銅)按照50:1的體積比配制，充分混勻，置于60℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

b．將蒸餾水空白、標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本各4 μL分別加到做好標(biāo)記的96孔板中，每個(gè)測(cè)定樣本3個(gè)水平重復(fù)。

c．每孔加入200 μL BCA工作液，充分混勻，蓋上板蓋，60℃孵育30 min。待冷卻至室溫，快速完成檢測(cè)。

d．用酶標(biāo)儀在562 nm處，測(cè)定每個(gè)樣本、標(biāo)準(zhǔn)品及空白管的吸光值，記錄數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

豌豆蚜取食含芥子油苷的人工飼料后，統(tǒng)計(jì)豌豆蚜的存活率、相對(duì)日均體重增長率和有翅蚜率(RRGR)，統(tǒng)計(jì)周期為20 d。

RRGR[25]計(jì)算公式如下：

式中W1是飼養(yǎng)前蟲體重量，W2是長至成蚜?xí)r的體重，發(fā)育歷期(DD)

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子油苷對(duì)豌豆蚜生長，存活的影響

紅色型和綠色型豌豆蚜取食含有不同濃度芥子油苷人工飼料的存活率、相對(duì)日均體重增長率和有翅蚜率如表所示(表1，2)。CK的存活率均高于90%。相比CK，取食含有不同濃度的芥子油苷的人工飼料不同時(shí)間后，紅色型和綠色型豌豆蚜的存活率均顯著降低。取食6 d后，紅色型和綠色型豌豆蚜的存活率和RRGR都隨著飼料中芥子油苷濃度增大而顯著降低(P<0.05)。取食6 d到12 d后，取食不同濃度人工飼料的豌豆蚜存活率在顯著降低，并且A1，A2和A3與CK之間差異顯著(P<0.05)。取食20 d后，除紅色型A1為15.5%，其余處理都在2%左右。紅色型和綠色型的RRGR隨芥子油苷濃度增大而逐漸降低，其中CK均為最高，分別為0.25%和0.24%。兩個(gè)色型豌豆蚜的有翅蚜率均隨著飼料中芥子油苷濃度的增大而增大。但僅A3與CK之間差異顯著(P<0.05)，分別為紅色型46.0%、綠色型43.3%。

表1 不同濃度芥子油苷對(duì)紅色型豌豆蚜生長存活的影響Table 1 Effect of different Glucosinolate on the growth and survival ment of red pea aphid

2.2 豌豆蚜可溶性蛋白總量測(cè)定

取食添加不同濃度芥子油苷的人工飼料3 d后，紅色型豌豆蚜體內(nèi)的可溶性蛋白總量相比CK顯著升高(P<0.05)，取食1 d和2 d后，僅2.86 μmol·g-1A3的可溶性蛋白總量相比CK顯著升高(P<0.05)(表3)。綠色型豌豆蚜取食添加不同濃度芥子油苷人工飼料后，體內(nèi)可溶性蛋白總量升高，在第3 d時(shí)A2和A3豌豆蚜體內(nèi)可溶性蛋白總量均顯著升高(P<0.05)(表4)。整體上，與紅色型豌豆蚜相比，綠色型豌豆蚜體內(nèi)的可溶性蛋白總量更容易被芥子油苷誘導(dǎo)。

表3 不同濃度芥子油苷對(duì)紅色型豌豆蚜可溶性蛋白總量變化的影響Table 3 Effects of different concentrations of glucosinolates on the total amount of soluble protein of pea aphid red

表4 不同濃度芥子油苷對(duì)綠色型豌豆蚜可溶性蛋白總量變化的影響Table 4 Effects of different concentrations of glucosinolates on the total amount of soluble protein of pea aphid green

2.3 不同濃度芥子油苷對(duì)豌豆蚜保護(hù)酶活性的分析

2.3.1SOD酶活性變化 豌豆蚜取食添加不同濃度芥子油苷人工飼料后，SOD酶活性變化如圖2所示。圖2-A表示紅色型豌豆蚜取食人工飼料后SOD酶活性的變化，結(jié)果表明，隨取食時(shí)間增加、芥子油苷濃度的升高，紅色型蚜蟲體內(nèi)的SOD酶的活性逐漸升高。除0.94 μmol·g-1處理1 d外，在不同時(shí)間的處理SOD酶活均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。圖2-B表示綠色型豌豆蚜取食人工飼料后SOD酶活性的變化，結(jié)果表明，隨蚜蟲取食時(shí)間增加、芥子油苷濃度升高，綠色型蚜蟲體內(nèi)的SOD酶的活性逐漸升高。取食不同濃度的芥子油苷不同時(shí)間后，綠色型豌豆蚜體內(nèi)的SOD酶活性均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。整體上而言，隨著人工飼料中芥子油苷濃度的升高，紅色型和綠色型豌豆蚜體內(nèi)的SOD酶活性均逐漸升高。與對(duì)照相比，紅色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工飼料后，SOD酶活性上調(diào)倍數(shù)高于相同處理的綠色型豌豆蚜。

表2 不同濃度芥子油苷對(duì)綠色型豌豆蚜生長存活的影響Table 2 Effect of different Glucosinolate on the growth and survival ment of green pea aphid

圖2 不同濃度芥子油苷處理人工飼料蚜蟲體內(nèi)SOD活性變化Fig.2 Changes of SOD activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

2.3.2POD酶活性變化 與SOD酶活性的變化類似，隨著人工飼料中芥子油苷濃度的升高，紅色型和綠色型蚜蟲體內(nèi)的POD酶的活性均逐漸升高(圖3)。紅色型和綠色型豌豆蚜在取食濃度為2.86 μmol·g-1的芥子油苷不同時(shí)間后，體內(nèi)的POD酶的活性上調(diào)最高。紅色型豌豆蚜取食濃度為0.94 μmol·g-1和1.87 μmol·g-1的芥子油苷不同時(shí)間后，除0.94 μmol·g-1處理2 d外，其余處理的POD酶的活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)。而綠色型豌豆蚜取食濃度為0.94 μmol·g-1和1.87 μmol·g-1的芥子油苷不同時(shí)間后，POD酶活性相比對(duì)照均顯著上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)高于相同處理的紅色型豌豆蚜(P<0.05)。整體上而言，與對(duì)照相比，綠色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工飼料后，POD酶活性上調(diào)倍數(shù)高于相同處理的紅色型豌豆蚜。

圖3 不同濃度芥子油苷處理人工飼料蚜蟲體內(nèi)POD活性變化Fig.3 Changes of POD activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

2.3.3CAT酶活性變化 豌豆蚜取食添加不同濃度芥子油苷人工飼料后，CAT酶活性變化如圖4所示。結(jié)果顯示，隨著人工飼料中芥子油苷濃度的升高，紅色型和綠色型豌豆蚜體內(nèi)的CAT酶活性均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。且與對(duì)照相比，紅色型豌豆蚜取食含有芥子油苷的人工飼料后，CAT酶活性上調(diào)倍數(shù)高于相同處理的綠色型豌豆蚜。

圖4 不同濃度芥子油苷處理人工飼料蚜蟲體內(nèi)CAT活性變化Fig.4 Changes of CAT activity in artificial feed aphid treated with different concentrations of glucosinolate

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果表明，在人工飼料中添加芥子油苷濃度為0.94 μmol·g-1，1.87 μmol·g-1和2.86 μmol·g-1，隨著芥子油苷濃度的增加，豌豆蚜存活率和相對(duì)日均體重增長率受到一定的抑制，對(duì)有翅蚜率具有促進(jìn)作用，這說明芥子油苷對(duì)豌豆蚜具有毒殺作用。在2.86 μmol·g-1時(shí)，不同時(shí)間內(nèi)豌豆蚜的存活率和相對(duì)日均體重增長率達(dá)到最低，而有翅蚜率卻達(dá)到最大。

植物產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)的功能主要表現(xiàn)在自身防御及繁衍后代2個(gè)方面，它們具有極其重要的生態(tài)學(xué)意義。唐仕娟[26]，邵婭等[27]人利用添加不同濃度齊墩果酸、單寧酸的人工飼料飼喂豌豆蚜，結(jié)果表明2種物質(zhì)對(duì)豌豆蚜的生長發(fā)育及繁殖具有一定的抑制作用。陳巨蓮等人將不同濃度的次生物質(zhì)添加到麥蚜全純?nèi)斯わ暳现校曃果滈L管蚜(Sitobionavenae)，結(jié)果表明單寧酸和總酚等植物次生物質(zhì)對(duì)麥長管蚜的生長發(fā)育有明顯的抑制作用；也說明單寧酸和總酚等植物次生物質(zhì)減緩了麥長管蚜的生長，使其體重逐漸下降。我們研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜取食芥子油苷后，其存活率和相對(duì)日均體重增長率也受到一定的抑制[28-29]。張海峰研究了芥子油苷對(duì)煙粉虱(Bemisiatabaci)生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明，芥子油苷的種類和含量都發(fā)生變化，這與煙粉虱的取食有關(guān)，煙粉虱的產(chǎn)卵量也出現(xiàn)差異，并且煙粉虱取食使芥藍(lán)芥子油苷含量上升，說明芥子油苷參與防衛(wèi)反應(yīng)并起重要作用[30]。Braendle研究發(fā)現(xiàn)紅色型豌豆蚜比綠色型豌豆蚜更容易離開寄主植物[31]，邵婭等[27]人通過含有單寧酸的人工飼料飼喂豌豆蚜，發(fā)現(xiàn)有翅蚜率隨單寧濃度的增加，先升高然后下降。本試驗(yàn)通過研究，結(jié)果表明芥子油苷對(duì)豌豆蚜有翅蚜率也具有促進(jìn)作用。

SOD，POD和CAT是昆蟲體內(nèi)抗氧化的保護(hù)酶，它們3者能互相協(xié)調(diào)一致，與體內(nèi)抵御外界病蟲害侵害及植物的次生物質(zhì)密切相關(guān)[32-33]。本研究表明，當(dāng)豌豆蚜取食不同濃度含有芥子油苷的人工飼料，隨著蚜蟲取食時(shí)間延長、芥子油苷的濃度升高，3種酶活性在逐漸升高。當(dāng)豌豆蚜取食2.86 μmol·g-1的芥子油苷人工飼料3 d時(shí)，其體內(nèi)的SOD，POD和CAT活性最高，而可溶性蛋白總量最小，說明芥子油苷對(duì)蚜蟲體內(nèi)酶活性有一定的促進(jìn)作用。由此可見，保護(hù)酶的酶活性變化對(duì)于昆蟲體內(nèi)抵御有害物質(zhì)起著重要的作用[34]。植食性昆蟲取食含大豆胰蛋白酶的飼料后，能夠調(diào)節(jié)自身的保護(hù)酶系統(tǒng)SOD，POD和CAT的活性作用，保護(hù)其不被受侵害[35]。朱香鎮(zhèn)等人通過研究在人工飼料中添加棉酚和蕓香苷2種植物次生物質(zhì)飼喂綠盲蝽(Apolyguslucorum)后，其能影響綠盲蝽體內(nèi)3種保護(hù)酶的變化，表明綠盲蝽受到不同外源次生物質(zhì)或者不同濃度外源次生物質(zhì)脅迫后，其體內(nèi)保護(hù)酶活性將發(fā)生顯著性變化，且是一個(gè)復(fù)雜的過程，不同酶的變化處于一種相互協(xié)調(diào)狀態(tài)，以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境條件的變化[36]。王亞軍[37]等人研究表明，苦參堿、氧化苦參堿和山奈酚這3種植物次生代謝物質(zhì)對(duì)舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶具有抑制作用，可能與苦參堿、氧化苦參堿和山奈酚對(duì)舞毒蛾幼蟲的殺蟲作用有關(guān)。

綜上所述，不同濃度的芥子油苷對(duì)豌豆蚜的生長存活有一定的抑制作用。雖然隨著蚜蟲取食時(shí)間延長、芥子油苷的濃度升高，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶酶活性逐漸升高，但豌豆蚜的存活率降低。豌豆蚜體內(nèi)的3種保護(hù)酶活性升高，但其在對(duì)豌豆蚜抵抗芥子油苷的過程中作用不明顯。應(yīng)進(jìn)一步分析芥子油苷對(duì)豌豆蚜解毒酶等活性及基因表達(dá)的影響，從而揭示芥子油苷對(duì)豌豆蚜的致死機(jī)理。