三維基因組與疾病

陳河兵 陶歡 伯曉晨 李程

人類基因組分布在染色質上，包含約30億個堿基對，如果我們每秒朗讀一個堿基，每天讀24小時，需要一個世紀的時間才能讀完。當基因組DNA完全以線性排列方式展開時，其長度可達2米，而容納基因組的細胞核只有幾微米。這么長的DNA是如何被裝進如此微小的細胞核中的呢？在這個過程中，DNA分子必定經歷了復雜的折疊，并在折疊的同時調控基因表達、參與機體發育，并和疾病的發生發展密切關聯。

奇妙的染色質結構

1953年，沃森和克里克提出了DNA分子雙螺旋模型，并因此獲得了諾貝爾獎。隨著電子顯微鏡的發展，科學家們發現了染色質的基本結構單位——核小體。核小體由DNA纏繞組蛋白八聚體形成，并通過DNA串連起來形成直徑為11納米的“串珠”結構。核小體螺旋化形成30納米的螺線管，進一步折疊形成300～700納米的染色質，并在細胞分裂期濃縮形成1400納米的染色體結構。整個過程中，基因組DNA被壓縮了8000～10 000倍，裝進細胞的遺傳信息儲存中心——細胞核中。

巧妙的高通量染色體構象捕獲技術

近年來，科學家發明了大量的方法來研究染色質的結構，主要包括基于電子顯微鏡的熒光原位雜交相關技術，以及基于測序的染色體構象捕獲技術。而本文主要關注染色體構象捕獲技術中的Hi-C技術及其衍生技術。

Hi-C技術及Hi-C衍生技術

2009年，科學家們研發了高通量染色體構象捕獲技術（high-through chromosome conformation capture， Hi-C），為揭示染色質三維結構提供了有力的技術支撐[1]。Hi-C技術將空間上相互作用的染色質通過甲醛固定，然后使用限制性內切酶切割基因組，并用生物素標記切割末端。再使用DNA連接酶連接帶有生物素富集標記的鄰近DNA片段，純化和打斷連接后的DNA分子，并篩選出帶有生物素標記的DNA片段，最后對DNA文庫進行高通量雙端測序。Hi-C技術將細胞核中染色質空間互作的信息轉換成測序信息，從而通過快捷的測序技術實現了全基因水平的染色質相互作用位點的識別。

在Hi-C技術的基礎上，目前已有多種Hi-C衍生技術被開發，這些方法簡化了Hi-C技術的實驗流程，降低了實驗噪聲和成本，推動了染色質高級結構的研究。國內課題組也在相關技術上取得了大量突破性進展，如高分辨率BL-Hi-C技術以及簡單高效的DLO Hi-C技術。筆者團隊也開發了不依賴于探針序列及蛋白抗體，以高效富集全基因組活躍轉錄調控元件間相互作用的OCEAN-C技術[2]。此外，筆者團隊還與其他團隊合作開發了基于Tn5轉座酶擴增DNA片段的少量細胞Hi-C技術（tagHi-C）[3]。

基于Hi-C識別的染色質多層級結構

Hi-C技術從一個新的角度展示了染色質的多層級結構。結合顯微成像技術，研究者們發現細胞核中每條染色體傾向于占據獨立不重疊的區域，這些區域被稱為染色體疆域，疆域內的染色質會形成不同的區室結構，根據轉錄活性不同，這些區室可以被分為轉錄活躍的A區室及轉錄抑制的B區室，同類區室內染色質的相互作用較多，不同類區室間染色質的相互作用較少。隨著測序精度的提升，研究人員發現區室內部1Mb左右的DNA組成了更小的空間結構，稱為拓撲關聯結構域 （topologically associating domain， TAD），TAD內一般包含8～10個基因，其內部的DNA元件之間形成了較為緊密的相互作用，而TAD間的染色質相互作用較少。相鄰TAD邊界上結合有染色質結構蛋白，如CTCF蛋白（CCCTC binding factor， CTCF）和黏連蛋白的蛋白復合體，這些蛋白起到組織染色質結構并隔離兩個相鄰的TAD之間互作的功能。TAD內部進一步包含染色質環，例如增強子—啟動子環。

隨著Hi-C測序技術逐步成熟，研究人員在染色質相互作用的圖譜中，觀察到更加精細的染色質相互作用模式，如染色質條帶。條帶反映了環擠出模型中染色質折疊過程中環形成時的動態情況。環擠出模型提出染色質環的形成是由染色質主動擠出機制介導的，其中CTCF蛋白附著在染色質上并隨之在黏連蛋白復合體中滑動，當遇到另一個方向相對的CTCF蛋白時會將染色質固定為環狀結構。染色質通過高度有序的多層級空間結構，限制順式作用元件的相互作用，輔助基因表達調控。

不可或缺的計算方法

采用Hi-C技術獲取的數據量很大，一個樣本可達到百GB級。為了通過Hi-C數據探究染色質的多層級結構，高效精確的計算方法不可或缺。另外，Hi-C技術仍存在分辨率不夠、公共數據積累有限等局限性，相應計算工具的開發則對這些不足進行了彌補。

基于Hi-C數據的染色質多層級結構分析方法

Hi-C數據可通過HiC-Pro、HiCExplore等軟件工具進行預處理，經過序列比對、數據過濾、圖譜構建、數據質控等過程，預處理后的Hi-C數據可以用于染色質區室、拓撲關聯結構域和染色質環等結構的識別。目前已有多種計算工具可基于Hi-C數據對染色質的各層級結構進行識別分析，例如識別區室結構的CscoreTools、SNIPER；識別拓撲關聯結構域的Arrowhead、Insulation Score、Directionality index、TADbit、OnTAD、MrTADFinder；識別環結構的HiCCUPS、Juicer、Fit-Hi-C等。這些工具的開發使得研究人員可以探尋不同物種基因組的三維結構、機體不同發育階段染色質高級結構的變化規律以及疾病狀態下的染色質結構的變異。

基于序列及表觀遺傳數據的預測方法

DNA序列特征及表觀遺傳修飾與染色質結構的形成和變化密切相關，目前已有多個數據庫提供了豐富的組織和細胞的序列及表觀基因組信息，且有多種計算工具嘗試通過序列和表觀遺傳數據預測染色質結構。筆者團隊近期對48種基于DNA序列及表觀遺傳信息進行染色質相互作用及高級結構預測的計算方法進行了總結、分類及性能比較，并對這些方法在不同生物領域中的應用進行了總結[4]。其中包括預測染色質環的CISD-loop、CTCF-MP、Lollipop和DeepMILO，預測拓撲關聯結構域的CITD、PGSA、TAD-Lactuca、nTDP和BART，預測染色質多聚模型的MiChroM、HiP-HoP、Chromatin states-based model，以及預測Hi-C相互作用圖譜的Rambutan、Akita和DeepC。這些工具可用于Hi-C數據缺乏時染色質高級結構的預測。

基于深度學習提升Hi-C數據的分辨率

Hi-C數據的分辨率直接影響染色質相互作用識別的有效性和準確性，目前大多數組織和細胞系仍缺乏高分辨率的Hi-C數據，通過大幅增加測序深度來獲取它們成本仍然較高，且隨著測序深度增加，指數增長的數據也給計算分析帶來了新的挑戰。筆者團隊開發的DeepHiC通過生成對抗網絡，提升Hi-C數據的分辨率，可以對染色質高級結構進行更加精準地預測[5]。DeepHiC提供了網絡運行界面（http：//sysomics.com/ deephic），用戶可以通過網頁提交數據，設定參數，計算后得到提升后的Hi-C數據[5]。

染色質高級結構與發育

細胞分化不同階段的基因組三維結構會發生動態變化，以此調控相關基因的表達，確保細胞可以正常發育并分化成特定的組織器官。研究表明，染色質高級結構在早期胚胎發育中具有重要作用，并與機體衰老密切相關。此外，在機體生長發育過程中，如果染色質高級結構出現異常，會影響細胞的正常分化，導致疾病的發生。

染色質高級結構與早期胚胎發育

哺乳動物的染色質多層級結構在早期胚胎發育過程中逐漸建立，并發生動態重排，從而調控DNA復制和修復、轉錄、X染色體失活等過程。染色質高級結構塑造了胚胎發育過程中基因表達的調控密碼，調控細胞分化和命運決定。研究者們曾揭示了哺乳動物成熟精子和卵子的染色體3D結構及早期胚胎發育過程中染色體結構的重編程變化，為深入了解哺乳動物早期胚胎發育過程打下了重要基礎。他們還揭示了人類早期胚胎中的染色體三維結構的動態變化，并發現CTCF蛋白對于早期胚胎發育中拓撲關聯結構域的結構具有重要的調控功能，為進一步揭示人類胚胎發育機制提供了理論基礎。此外，還有研究人員發現染色體的三維結構在受精后首先呈現出一種極其松散的狀態，并在隨后的胚胎早期發育過程中逐步地以親本特異的方式建立和成熟。他們與其他團隊合作通過體細胞核移植技術，發現核移植胚胎發育過程伴隨著劇烈的染色體高級結構的重編程，黏連蛋白具有形成拓撲關聯結構域和抑制minor ZGA基因的雙重功能，為研究早期胚胎發育過程中獨特的染色質高級結構的形成機制和功能提供了重要線索。

染色質高級結構與機體發育

染色質高級結構參與機體發育過程中的細胞譜系分化，維持機體的正常發育。染色質高級結構改變會影響基因調控，導致機體發育障礙。已有研究發現，拓撲關聯結構域內IHH基因座增強子的復制，會導致該基因表達發生組織特異性失調，與多趾癥的發生相關。而SOX9基因座的拓撲關聯結構域邊界復制異常，會導致新拓撲關聯結構域的形成，與烹調綜合征和短指等疾病相關。此外，先天性肢體畸形、自身免疫性疾病和性反轉等發育相關疾病也被證實與染色質高級結構失調相關。近日，筆者與其他團隊合作，開發了開放染色質致密度算法SDOC來表征染色質的結構變化，基于SDOC對T細胞分化過程的研究發現，在T細胞分化過程中，如果拓撲關聯結構域的結構發生變化，會抑制其他譜系基因的表達，表明染色質結構參與細胞分化和命運的調控[6]。

染色質高級結構與衰老

染色質高級結構在機體衰老進程中也發揮著重要的調控作用。研究人員結合多能干細胞定向分化技術、基因組靶向編輯技術，以及表觀遺傳組分析技術揭示了異染色質的高級結構失序是人類干細胞衰老的驅動力之一，為延緩和防治衰老相關疾病提供了新的潛在靶點和思路。

染色質高級結構與癌癥

癌癥是一種致死率極高的惡性疾病。在正常細胞轉變為腫瘤細胞的多階段轉化過程中，基因組常發生各種突變，如點突變、小片段的插入和缺失、染色質拷貝數變異和重排等。這些突變可能會造成基因組三維結構變異，如染色質區室轉換、拓撲關聯結構域及染色質環結構改變等，這些變異可能會導致原癌基因或抑癌基因表達異常，使細胞表現出永生化等惡性特征[7]。隨著有關癌癥與染色質空間結構變異關系研究的深入，以染色質高級結構為靶點的癌癥治療策略逐漸成為研究熱點。

染色質高級結構變異與癌癥

近日，有實驗室整合分析了結腸癌和正常結腸的高通量染色體構象捕獲技術數據、轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）及表觀遺傳數據，發現結腸癌中基因組區室發生了廣泛重組，A區室和B 區室之間存在重組的中間區室。在正常細胞中，中間區室更趨近于A區室，而在癌細胞中，中間區室普遍處于低甲基化狀態，更趨近于B區室 。通過結直腸腫瘤隊列的數據分析發現，區室變化相關的轉錄特征可以用于預測患者的預后和轉移。

染色質拓撲關聯結構域作為染色質空間結構的基本單位，其結構變異會導致染色質相互作用的改變，從而促使新的調控元件和基因接近，影響基因表達，參與細胞惡化過程。筆者團隊對骨髓瘤細胞與正常B細胞的高通量染色體構象捕獲技術數據、全基因組測序數據及RNA-seq數據進行整合分析發現，與正常細胞相比，骨髓瘤細胞中拓撲關聯結構域的數量增加，平均長度減小。基因組中的染色質拷貝數變異斷點經常分布在拓撲關聯結構域的邊界，提示拓撲關聯結構域邊界的拷貝數變異位點更容易發生DNA鏈斷裂或被癌細胞克隆選擇[8]。此外，還有研究團隊通過T 細胞急性淋巴細胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia， T-ALL）的研究發現，T-ALL中染色質拓撲關聯結構域的結構變異，導致T-ALL重要致病基因MYC的異常表達。

此外，還有研究團隊發現了脈絡膜黑色素瘤特異性染色質環結構，使神經降壓素基因的啟動子區域與上游800 kb處的增強子相互作用，導致神經降壓素的異常高表達，促進了脈絡膜黑色素瘤細胞的增殖和遷移。

基于三維基因組的癌癥治療

隨著Hi-C及其衍生技術的逐步成熟，染色質高級結構與疾病的關系逐漸被發現，三維基因組也成為了抗癌治療的潛在靶標。筆者團隊整合了公共Hi-C數據和染色質免疫共沉淀測序數據，構建了評價疾病相關染色體重排對基因組三維結構影響的統計學方法，篩選出潛在由于三維結構改變導致疾病發生的染色體重排數據，并開發了3Disease Browser網站（http：//3dgb. cbi.pku.edu.cn/disease/）用于集成和可視化疾病相關染色體重排與鄰近的染色體三維結構[9]。另外，筆者團隊還結合三維基因組、千人基因組項目、表觀遺傳修飾和基因組序列特征，建立非編碼變異與其相互作用靶基因之間關聯的數據庫和網站3DSNP（http：//www. cbportal.org/3dsnp/）[10]。

近年來，以染色質三維結構為靶標的抗癌療法逐漸被開發。有實驗室開發了一種癌癥治療策略——染色質保護療法，從染色質整體構象出發，通過改變染色質的包裝密度，阻止癌癥的適應性。在使用具有改變染色質包裝密度作用的塞來昔布和地高辛兩種藥物聯合化學藥物處理癌細胞后，研究人員發現癌細胞在兩三天幾乎被全部殺死，表明通過藥物靶向染色質高級結構的方法改變細胞適應性，聯合現有癌癥療法能夠有效殺死癌細胞。另外，另一研究團隊基于Hi-C、RNA-seq和CTCF的ChIP-seq數據，發現了人類急性白血病中的染色質三維結構變化，并證明靶向NOTCH1信號通路的γ-內分泌酶抑制劑可以改變白血病中發現的特定染色質3D相互作用。

染色質構象捕獲技術結合相關計算工具的開發，極大地促進了對染色質三維空間結構及其在基因表達調控、細胞增殖分化、機體發育及疾病發生發展中作用機制的理解。染色質高級結構的研究將推動人們進一步探索染色質高級結構失調與疾病發生發展的關系，為癌癥等疾病的診療提供潛在靶點。

[1]Lieberman-Aiden E， van Berkum N， Williams L， et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science， 2009， 326（5950）： 289-293.

[2]Li T， Jia L， Cao Y， et al. OCEAN-C： mapping hubs of open chromatin interactions across the genome reveals gene regulatory networks. Genome Biology， 2018， 19（1）： 54.

[3]Zhang C， Xu Z， Yang S， et al. tagHi-C reveals 3D chromatin architecture dynamics during mouse hematopoiesis. Cell Reports， 2020， 32（13）： 108206.

[4]Huan Tao H L， Kang Xu， Hao Hong， et al. Computational methods for the prediction of chromatin interaction and organization using sequence and epigenomic profiles. Briefings in Bioinformatics， 2020.

[5]Hong H， Jiang S， Li H， et al. DeepHiC： A generative adversarial network for enhancing Hi-C data resolution. PLoS Computational Biology， 2020， 16（2）： e1007287.

[6]Jiang S， Li H， Hong H， et al. Spatial density of open chromatin： an effective metric for the functional characterization of topologically associated domains. Briefings in Bioinformatics， 2020.

[7]Li R， Liu Y， Hou Y， et al. 3D genome and its disorganization in diseases. Cell Biology and Toxicology， 2018， 34（5）： 351-365.

[8]Wu P， Li T， Li R， et al. 3D genome of multiple myeloma reveals spatial genome disorganization associated with copy number variations. Nature Communications， 2017， 8（1）： 1937.

[9]Li R， Liu Y， Li T， et al. 3Disease Browser： A Web server for integrating 3D genome and disease-associated chromosome rearrangement data. Scientific Reports， 2016， 6： 34651.

[10]Lu Y， Quan C， Chen H， et al. 3DSNP： a database for linking human noncoding SNPs to their three-dimensional interacting genes. Nucleic Acids Research， 2017， 45（D1）： D643-d649.

關鍵詞：染色質三維結構 Hi-C 發育 疾病 ■