獸藥殘留檢測方法驗證探究

任 展，夏夢雯

（漢源縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗檢測站，四川漢源 625300）

方法驗證是實驗室建立可靠分析系統(tǒng)的基礎，是實驗室證明其具備技術(shù)能力運用新標準進行檢測，是實驗室證明其所得檢測結(jié)果準確性、可靠性的一種手段。實驗室在初次使用標準方法前、在標準方法發(fā)生變化時，應對標準方法進行驗證，并提供相關證明材料。因此，基于農(nóng)業(yè)部2386 號公告和NY/T 1896-2010 中方法驗證的要求，在進行方法驗證時應對方法性能指標選擇性、檢出限、定量限、線性范圍、正確度、精密度和穩(wěn)健性進行驗證。

1 方法性能參數(shù)的驗證及其質(zhì)量控制要求

1.1 選擇性

標準方法已經(jīng)采取了必要的手段排除了重大干擾物質(zhì)對分析方法的影響，但對于應用方法的實驗室驗證，應依據(jù)檢測方法的程序檢查因試劑耗材、器皿、基質(zhì)等因素所導致的干擾情況。

1）試劑空白。對試驗中所用到的試劑，按照檢測方法的要求進行測試，觀察色譜圖中的出峰，以檢查在整個試驗過程中所用的試劑、器皿及其他試驗用品是否對目標組分的分析存在干擾；

2）使用有證標準物質(zhì)配制一定濃度的單一目標組分標準工作溶液和多目標組分的混合標準工作溶液，上機確定各目標組分保留時間、分離度、峰形及峰面積。該測試數(shù)據(jù)及圖譜可以為目標組分的識別和含量計算、考察配制的標準溶液有效期提供初始比對依據(jù)；

3）根據(jù)類別分析不同基質(zhì)的空白樣品，檢查在目標物出現(xiàn)的區(qū)域是否存在干擾；

4）在有代表性空白樣品中添加一定濃度目標組分進行檢測，檢查目標組分在圖譜中的出峰區(qū)域是否有干擾。

1.2 檢出限

對于有允許限量規(guī)定的目標分析物，獨立檢測檢出限濃度水平下制備的10 個標準添加樣品，目標組分檢出概率應達到50%；對于規(guī)定為不得檢出的目標分析物，在此濃度水平下獨立檢測20 個加標樣品，檢出概率應達到95%。

1.3 定量限

在標準所限定的檢測范圍，制備定量限濃度水平下的標準添加樣品，依據(jù)檢測方法進行試驗，依據(jù)農(nóng)業(yè)部2386 號公告或NY/T 1896-2010 對檢測結(jié)果的正確度和精密度進行評價，以此判斷實驗室檢測能力能否達到方法的定量限。

1）使用空白樣品制備7 個定量限濃度水平下標準添加樣品；

2）檢測上述樣品，得到相應的響應信號（如峰面積、峰高等），并計算出樣品前處理后目標組分的濃度（或量），根據(jù)添加量計算出該濃度水平的添加回收率及平行樣品間的相對標準偏差；

3）得到的回收率和相對標準偏差應滿足規(guī)范中相應的濃度水平下的回收率和相對標準偏差要求。

1.4 線性范圍

校準曲線（一般為線性曲線）至少做5 個濃度點（不包含空白濃度點），濃度范圍盡可能覆蓋2 個數(shù)量級，每個濃度點重復配制2～3 個，定量限、最大殘留限量或10 倍定量限及被測樣品中目標組分濃度應在校準曲線的范圍內(nèi)，曲線相關系數(shù)不低于0.997。列出校準曲線的回歸方程、相關系數(shù)，并附上機檢測的色譜圖。

1.5 正確度

一般采用測定添加回收率的方法對農(nóng)、獸藥藥物殘留的正確度進行評價。添加回收試驗一般做3個濃度水平，每個水平重復檢測不少于3 次，并計算同一水平下檢測結(jié)果平均值及添加回收率［1］。

1）對于禁用藥物，在方法定量限、2 倍方法定量限和10 倍方法定量限進行3 水平添加回收試驗；

2）對于已制定最大殘留限量的藥物，在1/2 最大殘留限量、最大殘留限量、2 倍最大殘留限量3 個水平點進行試驗，如果最大殘留限量值是定量限，可參考禁用藥物進行試驗；

3）對于未制定最大殘留限量的，可在方法定量限、常見限量指標和某一適當點進行3 水平試驗。

1.6 精密度

在重復性的測試中自由度至少應為6。即對一個樣品至少平行測定7 次；對2 個樣品每個樣品至少平行測定4 次；對3 個樣品每個樣品至少平行測定3 次。

重復性的試驗可采用在空白樣品中添加一定濃度的目標分析物，然后在較短的時間內(nèi)由同一個檢測人員進行測定，并計算結(jié)果的平均值、標準偏差和相對標準偏差（即變異系數(shù)）。

1.7 穩(wěn)健度

穩(wěn)健度主要是指可通過由實驗室人員預先設計好的微小的合理變化因素，并綜合分析它們的直接影響。對穩(wěn)健度考察的分析方法來源于《化學分析實驗室協(xié)同試驗設計及統(tǒng)計分析手冊》，采用7 因素2 水平的正交試驗對穩(wěn)健度進行驗證［2］。

1）查找在樣品預處理、提取、凈化、分析等過程中可能影響檢測結(jié)果的因素。可以包括不同來源試劑耗材、不同樣品、不同溫度、不同pH 值及其他可能出現(xiàn)的因素。對變量進行考察時，同一因素不同水平的值推薦為方法規(guī)定值的±10%，如稱樣量為5.00 g，其穩(wěn)健度考察水平為4.50 g 和5.50 g；消解時硝酸的加入量為10 mL，其穩(wěn)健度考察水平為9 mL 和11 mL［3］。

2）實驗室應仔細分析影響因素，從中選擇7 個重要因素作為考察對象。如果所要考察的因素數(shù)量多于7 個，可設計多個試驗方案；相反考察的因素不到7 個，例如只考察6 個因素，則最后一個因素可以設為常量而不需要進行考察，但列為常量的因素也應納入計算和統(tǒng)計。7因素2 水平正交試驗表見表1。

3）將各大寫的因素和小寫的因素分為2組，由此計算各個因素變化對結(jié)果的影響量。如因素從G 到g 變化的影響量可由編號1、4、6、7 號試驗結(jié)果的平均值和編號2、3、5、8 試驗結(jié)果的平均值之間的差值得出。當2組計算公式相減求G 到g 因素變化對結(jié)果影響量時，大寫因素A 到F 和小寫因素a 到f 均在2組平均值公式中出現(xiàn)了2次，2平均值相減后，A/a 到F/f 因素變化對結(jié)果的影響均被抵消，按此方式可求得A/a 到G/g 到各因素變化對結(jié)果的影響量［4］。

4）計算該穩(wěn)健性試驗條件下8 次測定結(jié)果的標準偏差，將其與上述7 個影響量進行比較，如果影響量大于2 倍標準偏差，則該因素的影響是顯著的。在總結(jié)驗證結(jié)果時，應特別指出，并要求檢測人員小心地控制，必要時編制作業(yè)指導書。

2 結(jié)語

實驗室基于對影響因素的有效控制為前提，以節(jié)約人力、物力、財力、提高工作效率和易于操作為原則對方法性能指標進行驗證。筆者只對方法性能指標的驗證方式進行了論述，實驗室還應依據(jù)相關標準、規(guī)范要求對人員、儀器設備、環(huán)境等因素進行考察，以證明實驗室具備相應的能力運用該方法［5］。

1）選擇性。色譜檢測結(jié)果的定性是基于目標物的保留值，但僅根據(jù)保留值對一個完全未知的樣品定性是不可靠的。在人員、試劑耗材、標準物質(zhì)、儀器設備和環(huán)境條件一定的條件下，在分析中應盡量選擇不同種類有代表性的樣品進行驗證，以確定樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾情況。為確保檢測結(jié)果的準確，出現(xiàn)陽性結(jié)果時，實驗室應對檢測結(jié)果進行復檢［6］。

2）檢出限和定量限。在實際檢測工作中，檢測結(jié)果在方法檢出限以下時，報告為“未檢出”，并標注出目標物的方法檢出限；檢測結(jié)果在方法定量限以上時，報告檢測結(jié)果；檢測結(jié)果在檢出限以上，定量限以下時，檢測結(jié)果報告為“定性檢出”［7］。

3）線性范圍。由于色譜檢測器穩(wěn)定性的問題，其響應值隨時間在變化，在實驗檢測工作中如采用標準曲線校正，每條曲線使用的時間往往比較短，反復校正曲線工作量比較大；在實際檢測工作中通常使用單點粗篩，對陽性或超標樣品，配相近的濃度點標準溶液或基質(zhì)標液進行校正［8］。

4）正確度和精密度。精密度的驗證可與正確度的驗證同步進行，試驗的濃度水平依據(jù)正確度的驗證要求進行選取，試驗的結(jié)果應達到相關標準和規(guī)范的要求。

5）穩(wěn)健性。建議采用關注濃度水平下的標準添加樣品作為穩(wěn)健性考察的樣品。如果將稱樣量作為一個考察因素，加標時應確保每一份試樣中加入的目標分析物的質(zhì)量分數(shù)是一致的，以免人為的放大稱樣量對結(jié)果的影響。