基于Ki-67增殖指數判定的數字化分析在胃腸胰神經內分泌腫瘤分級中的應用

涂 軼，曹 毅，徐 姍，鄭紫純，周志斌，梅金紅

神經內分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasm, NEN)是一組起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的異質性腫瘤[1]。胃腸胰分布多種神經內分泌細胞，是NEN最常發生的部位，約占所有NEN的75%，目前已成為消化道常見的惡性腫瘤[2]。NEN增殖活性的級別判定主要采用核分裂象和(或)Ki-67增殖指數兩項指標，在國內，大多采用Ki-67增殖指數對NEN進行分級，準確的腫瘤分級對于指導NEN患者的治療及預后評估具有重要作用。人工精確計數法對Ki-67增殖指數判讀較為準確，但其需計數500～2 000個細胞，耗時長，診斷效率低。因此，目前對于Ki-67增殖指數評估仍以病理醫師目測估計顯微鏡下的組織切片為主，該方法簡單、方便，但具有較強主觀性，結果可重復性差，造成Ki-67增殖指數判讀不準確[1]。騰訊精準醫療開放平臺通過一體化全自動掃描平臺，將傳統的玻璃切片進行掃描，生成包括傳統玻璃切片內的所有信息的數字化切片，通過軟件對切片信息進行分析，進行Ki-67增殖指數的判讀，具有高效、結果可重復等優點。本實驗擬驗證基于Ki-67增殖指數判定的數字化NEN分析的精確性，及與人工精確算法的一致性，探討采用數字化手段對Ki-67增殖指數判定的可行性，以解決當前Ki-67人工目測評估進行腫瘤分級所存在的結果可重復性差、耗時、主觀性強等問題。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取2016年1月～2020年11月南昌大學第一附屬醫院病理科確診的349例胃腸胰NEN的Ki-67免疫組化病理切片，包括分級在G1、G2、G3的各級胃腸胰NEN。其中G1期278例，G2期20例，G3期51例。腫瘤位于直腸232例，胃67例，胰腺31例，乙狀結腸8例，右半結腸7例，十二指腸3例，回盲部1例。

導入各病例原病理報告Ki-67增殖指數判斷結果作為病理醫師目測評估腫瘤細胞Ki-67增殖指數。

1.2 數據處理及分析使用尼康顯微鏡進行NEN Ki-67免疫組化切片觀察。每張切片先在低倍鏡(40×)下確認陽性率最高的區域，再調整為中倍鏡(200×)精確定位Ki-67陽性率最高的區域，運用數字化切片掃描儀(Motic EasyScanner)記錄數字化切片圖像。為保證足夠的細胞數目，對于神經內分泌組織細胞比較多且存在明顯Ki-67熱點的切片，選取2～3幅包含陽性率最高區域的圖片；對于NEN細胞比較少或無明顯Ki-67熱點的切片，則選取包含切片中全部腫瘤組織的圖片，確保每例至少500個腫瘤細胞進行評估。運用Photoshop CS5進行圖像處理，主要對圖片中非腫瘤區域(如間質及正常胃腸黏膜組織)進行切割，調節圖片的亮度以滿足騰訊精準醫療開放平臺軟件對于圖像的要求，去除圖片中較明顯的非細胞污點(如切片久置被污染所致的污點等)。通過騰訊精準醫療開放平臺軟件數字化分析(簡稱數字化分析)進行Ki-67增殖指數分析，每例均上傳其對應的圖片及背景色圖片，然后保存分析結果圖片(圖1、2)。

圖1 Ki-67增殖指數，人工精準計數結果分別為：<1%(A)、5%(B)、30%(C)；病理醫師目測Ki-67增殖指數結果分別為3%、4%、35% 圖2 騰訊精準醫療開放平臺軟件數字化分析Ki-67增殖指數結果，分別為<1%(A)、5%(B)、31%(C)

對每個NEN病例的Ki-67免疫組化圖片進行人工計數精確評估Ki-67增殖指數。選取Ki-67陽性率最高的圖片進行人工計數，分別數出Ki-67陽性核(褐色著色)的個數和陰性核(藍色著色)的個數。如果1幅圖片的總細胞數目小于500，則選取余下幾張圖片里Ki-67陽性率最高的圖片繼續進行人工計數，直至累計總細胞數目超過500。計算Ki-67陽性核腫瘤細胞數占總細胞數的百分比并記錄。

用Excel軟件繪制人工精確計數與數字化分析結果的散點圖。再運用Excel軟件散點圖中“添加趨勢線”，選擇“線性”對圖像進行線性擬合，并顯示公式。運用SPSS 20.0軟件對兩種計數結果進行配對t檢驗。運用Graphpad 8.0軟件分別對G1、G2及G3期的數字化分析與人工精確計數，病理醫師目測與人工精確計數進行Bland-Altman一致性檢驗分析。

2 結果

從分析時間上看，數字化分析出結果的時間是3～5 s，不同組織大小掃描時間不一，500個腫瘤細胞掃描時間約在1 min以內，截圖及上傳圖片時間約10 s；人工精確計數的時間是3～5 min；醫師目測法判定Ki-67增殖指數結果約10 s。

在時效上數字化分析效率優于人工精確計數。

數字化分析結果與人工精確計數的比較結果顯示兩者具有較好的相關性，其線性相關系數為0.985，且SPSS軟件t檢驗結果顯示兩者Pearson相關系數為0.997，差異有統計學意義(P<0.000 1)。

數字化分析與人工精確計數相比，G1期278例配對數據差值的均數d=-0.028 8，差值的標準=0.267 6，95%一致性界限為[-0.553 4，0.495 7]。G2期20例配對數據差值的均數d=-0.400 0，差值的標準=1.231，95%一致性界限為[-2.813，2.013]。G3期51例配對數據差值的均數d=0.902 0，差值的標準=5.155，95%一致性界限為[-9.201，11.01]。

病理醫師目測與人工精確計數相比，G1期278例配對數據差值的均數d=0.083 0，差值的標準=0.356 6，95%一致性界限為[-0.615 8，0.781 9]。G2期20例配對數據差值的均數d=1.850，差值的標準=0.933 3，95%一致性界限為[0.020 7，3.679]。G3期51例配對數據差值的均數d=-4.020，差值的標準=10.03，95%一致性界限為[-23.68，15.64]。

數字化分析與病理醫師目測法相比，G1期278例配對數據差值的均數d=0.111 9，差值的標準=0.479 8，95%一致性界限為[-0.828 4，1.052]。G2期20例配對數據差值的均數d=2.250，差值的標準=1.293，95%一致性界限為[-0.283 7，4.784]。G3期51例配對數據差值的均數d=-4.902，差值的標準=10.75，95%一致性界限為[-25.97，16.17]。

由此可見，數字化分析與人工精確計數在G1、G2及G3期均具有較好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期。且數字化分析與人工精確計數的一致性均高于病理醫師目測與人工精確計數以及數字化分析與病理醫師目測的一致性，差異有統計學意義。

3 討論

NEN是一類起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的異質性腫瘤，可發生于全身多器官和組織，包括胃腸道、胰腺、膽道、肝臟、肺支氣管、甲狀腺及甲狀旁腺等部位。NEN的早期診斷率低，確診時往往出現轉移，病死率居高不下，近年來受到越來越廣泛的重視。此前較長一段時間內，對NEN的命名、分類、診斷及治療均缺乏統一和規范，仍存在諸多尚待解決的問題[3]。

WHO(2010)消化系統腫瘤分類對NEN命名、分類和分級進行了修訂，將NEN分為高分化的神經內分泌腫瘤(neuroendocrine tumor, NET)G1期(Ki-67增殖指數<3%)、G2期(Ki-67增殖指數為3%～20%)和分化差的神經內分泌癌(neuroendocrine carcinoma, NEC)G3期(Ki-67增殖指數>20%)三部分，認為高分級G3即為分化差的NEN[4]。WHO(2017)消化系統腫瘤分類進一步將NEN G3分級細化為高增殖活性的NET G3及NEC G3。高增殖活性NET G3 Ki-67增殖指數通常為20%～50%，NEC G3期Ki-67增殖指數>50%[5]。指南明確指出完整的病理報告中需要包括確切的Ki-67增殖指數[6]，這對指導NEN患者的治療及預后評估具有重要意義。

目前對Ki-67增殖指數的判讀主要人工判讀為主，傳統的人工判讀Ki-67增殖指數存在以下缺點：(1)精確性低，病理醫師通過肉眼在顯微鏡下短時間內判讀一張病理切片，準確性不高；(2)主觀性強，選取的視野不同，對陽性信號的判讀不同，均可導致判讀結果有差異；(3)重復性差，不同病理醫師之間、同一病理醫師不同時期的閱片均存在明顯差異[7-8]。此外，新版診治標準中強調了組織標本量對分級判斷可靠性的影響，腫瘤細胞數量不足，分級可能會被低估，從而難以得到準確的評估分級結果。病理醫師目測估計計數存在上述的諸多問題，可能導致Ki-67增殖指數判定誤差，從而影響NEN的分級及術后治療、預后判斷。相比傳統的人工判讀，數字化分析在以下幾方面具有優勢：(1)與病理醫師目測估計計數相比，采用數字化分析方法，對Ki-67增殖指數進行判讀，準確率高，因此Ki-67增殖指數的判讀結果更可靠；(2)省時省力，在完成切片掃描后，對于選定的視野只需數秒就可完成閱片過程；(3)客觀性好，判斷標準統一，在判斷陽性標準設定后，所有切片均會按相同條件進行判讀，計算陽性率；(4)重復性好，可以進行多視野計數，雖然本實驗僅選取2～3個視野進行計數，但在實際工作中，機器判讀可以選取任意更多的有代表性的區域，甚至可以進行整片計數，最大限度的保證了閱片結果的穩定性。機器判讀更注重細節且更易進行質控[9]。

本組共納入349例確診為胃腸胰NEN并進行Ki-67免疫組化的病理切片，通過Pearson相關系數檢測數字化分析與人工精確計數對診斷Ki-67的相關性，結果顯示數字化分析與人工精確計數具有良好相關性。其次，通過Bland-Altman一致性檢驗分析數字化分析與人工計數對G1、G2及G3期的Ki-67增殖指數精確度比較，結果顯示數字化分析與人工精確計數在G1、G2及G3期均具有較好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期，且G1、G2、G3期數字化分析與人工精確計數的一致性均高于病理醫師目測與人工精確計數以及數字化分析與病理醫師目測的一致性。因此，通過上述結果，可以初步得出，數字化分析Ki-67增殖指數并協助診斷NEN具有很好的臨床應用價值，其準確性優于人工精確計數。因本實驗是單中心、小樣本的回顧性分析，則需要更大樣本量、多中心、前瞻性研究進一步證明通過機器數字化分析Ki-67增殖指數對確診和分級NEN的價值，從而為病理科醫師診斷NEN提供更加準確、快速的檢測方法和循證學依據。

綜上所述，本實驗初步認為數字化分析進行NEN的Ki-67增殖指數判斷，相比病理醫師目測估計，能夠更好地保證有效的腫瘤細胞數，數字化判定結果較病理醫師目測估計更為精確，與金標準人工精確計數相比具有很好的一致性。數字化分析可能成為精確評估Ki-67增殖指數的新方法，從而進行腫瘤惡性程度的準確分級，解決當前Ki-67增殖指數人工目測評估精確性差、費時、主觀性強、可重復性差的問題，并有望在診斷其他惡性實體腫瘤的免疫組化指標判定上進行推廣。