試劑盒制備胸腹水細胞蠟塊的應(yīng)用體會

高麗麗，蘇紅丹，劉 華，李 青

細胞學(xué)標(biāo)本處理技術(shù)多種多樣。細胞涂片是最早和最簡單的技術(shù)，液基細胞學(xué)檢查始于20世紀90年代[1]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用，并實現(xiàn)半自動化和標(biāo)準(zhǔn)化。細胞蠟塊是另一種常用的細胞學(xué)技術(shù)，自1999年被Kathleen等[2]報道以來，目前已有多種細胞蠟塊制作技術(shù)[3]，但該領(lǐng)域還未形成明確的標(biāo)準(zhǔn)。與組織學(xué)標(biāo)本類似，細胞蠟塊保留了一些組織結(jié)構(gòu)，并可進行多次切片。細胞蠟塊技術(shù)較大程度上與其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的模式轉(zhuǎn)變相吻合。首先，臨床出現(xiàn)更多的微創(chuàng)手術(shù)，包括內(nèi)鏡下超聲引導(dǎo)和支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下的穿刺樣本。其次，依賴個性化藥物需要通過輔助研究來確定的診斷，包括免疫組化染色和分子檢測，一些研究報道均肯定了細胞蠟塊技術(shù)應(yīng)用的輔助診斷價值。另一些研究報道也提出了其不理想結(jié)果[4-8]。日常工作中，技術(shù)人員操作不當(dāng)或非標(biāo)準(zhǔn)化的實驗流程，均會影響細胞蠟塊的質(zhì)量和細胞特性從而影響診斷結(jié)果。本實驗使用試劑盒制備細胞蠟塊，操作簡單、流程標(biāo)準(zhǔn)化，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年4～8月上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院病理科存檔的胸腹水脫落細胞樣本40例。

1.2 試劑試劑盒(圖1)購自昆明東環(huán)科技公司：(1)專用離心管(基質(zhì))；(2)細胞固定液；(3)紅細胞裂解液；(4)配套使用設(shè)備：干式恒溫器。關(guān)鍵組成成分——專用離心管，由離心管和2個離心管蓋構(gòu)成，離心管為兩端開口的圓柱形中空管，管內(nèi)裝有基質(zhì)，離心管有兩種規(guī)格：內(nèi)徑8 mm和4 mm(可用于處理微量細胞)。制備原理：將細胞混懸液加入含有基質(zhì)的離心管，通過離心將細胞富集到一個平面上，最后將凝固后帶有細胞層的基質(zhì)取出并切下細胞塊。分離后的細胞有序排列，腫瘤細胞、細胞團位于最下層，首先被切割成細胞塊。

圖1 細胞蠟塊制備試劑盒：A.試劑和離心管；B.配套設(shè)備干式恒溫器

1.3 方法(1)細胞收集：臨床采集到的細胞學(xué)標(biāo)本，經(jīng)1 500 r/min離心5 min沉淀細胞，吸去上清液。(2)紅細胞裂解：向細胞沉淀中加入5倍以上體積的紅細胞裂解工作液(儲存液與蒸餾水按1 ∶9配制)，輕輕混勻后放置5 min，然后，1 500 r/min離心5 min沉淀細胞，吸去紅色的上清液。(3)細胞固定：向沉淀細胞中加入細胞體積5倍以上的細胞固定液，用吸管將細胞沉淀輕輕吹打成分散的細胞或細胞團，并預(yù)固定10 min。液基保存細胞無需進行再固定。(4)基質(zhì)熔化：將專用離心管置于金屬浴上，85 ℃加熱15 min以上，使基質(zhì)完全液化。(5)加樣混勻：取出專用離心管，將預(yù)固定的細胞固定混勻液加入離心管中，用吸管反復(fù)抽吸使細胞混懸液和基質(zhì)充分混勻。(6)離心：趁熱立即離心，1 500 r/min離心5 min。(7)凝固基質(zhì)：離心后，將置于4 ℃冰箱冷卻10 min以后又經(jīng)室溫放置20 min，使基質(zhì)充分凝固。(8)取材：擰開兩端離心管蓋，撕去密封膜，用棉簽將含有細胞的基質(zhì)端推出離心管，用刀片切下3 mm厚的細胞端，最下層細胞向下放入包埋盒中，進行常規(guī)脫水、包埋、切片、HE和免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 細胞蠟塊本組40例樣本均成功制作成細胞蠟塊。本方法制得的蠟塊細胞量充分，切面形狀規(guī)則，可連續(xù)切片和長期保存。

2.2 HE染色細胞量豐富，染色清晰，細胞紅藍對比鮮明，易于閱片(圖2A)。

2.3 免疫組化染色陽性定位準(zhǔn)確，強度適宜，背景干凈(圖2B、C)。

3 討論

目前對于制備細胞蠟塊的標(biāo)準(zhǔn)尚無共識，一些實驗室對其細胞塊的質(zhì)量不完全滿意。組織學(xué)標(biāo)本的處理是直接放入包埋盒中，細胞學(xué)標(biāo)本不適用該方法。細胞學(xué)標(biāo)本需要離心，丟棄上清液后的沉淀物很難從離心管的底部吸取出來，而且易破碎。為解決這個問題，有實驗使用“乙醇-吸管”法[9]，用吸管輕輕吸取細胞沉淀，但是離心后需經(jīng)30 min乙醇固定，增加了實驗時間。另有實驗應(yīng)用組織凝膠法[10]和液體膠法[11]，組織凝膠由瓊脂糖組成，加熱時液化，冷卻時凝固，但操作步驟較繁瑣；液體膠法是用液體膠將離心后的細胞沉淀物粘連。以上方法在概念上均較簡單——離心、去除上清液、添加膠粘劑，但細胞蠟塊的質(zhì)量取決于技術(shù)員的經(jīng)驗。

使用試劑盒制備細胞蠟塊解決了以上問題，除了增加細胞量，最重要的是操作簡單，流程標(biāo)準(zhǔn)化。細胞數(shù)量的增加是由于在封閉的樣品“腔”中捕獲和保留細胞的能力，這減少了在多次轉(zhuǎn)移/處理過程中標(biāo)本的損失(如離心管、組織包埋盒)。試劑盒內(nèi)包含專用離心管，具有預(yù)定的規(guī)格，包括4 mm(每管0.4 mL)和8 mm(每管1.2 mL)，可以根據(jù)細胞量選擇合適的離心管。離心管上下均有管蓋，可直接擰開下端管蓋取出細胞沉淀，減少細胞的損失量。離心管直接放入配套的金屬浴裝置中，無需配制瓊脂糖溶液。因此，使用試劑盒可減少對技術(shù)員操作技能的依賴，流程簡單，易掌握。

試劑盒制備細胞蠟塊需注意：(1)離心管內(nèi)基質(zhì)加熱凝固后第2天再加熱對基質(zhì)的性質(zhì)無影響；(2)配制好的紅細胞裂解液(工作液)，在密閉容器中可使用3個月；(3)切下的細胞塊要將最下層細胞(含有病變細胞)向下放入包埋盒，包埋時最下層細胞也要向下。

本實驗絕大多數(shù)樣本為液體，非細針穿刺標(biāo)本。后續(xù)實驗需要擴大到包括各種標(biāo)本類型。目前，常用細胞蠟塊制備技術(shù)的有用性和改進的必要性得到了充分認識。細胞蠟塊處理需要改進和標(biāo)準(zhǔn)化，我們相信試劑盒制備細胞蠟塊提供了潛在的選擇。