經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌中CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1的表達(dá)及臨床意義

秦燕子，吳晨辰，蔡兆根，馮振中，柴大敏，馬 莉

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中最常見的類型，大部分患者預(yù)后良好，10年生存率可達(dá)80%～90%，病死率較低[1]，但其易較早出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此需盡早治療。經(jīng)典型是最常見的PTC類型，具有特征性的乳頭狀結(jié)構(gòu)和典型的PTC核特征，即核內(nèi)假包涵體、核溝、毛玻璃樣和砂粒體等[2]。殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase 3-like 1, CHI3L1)又稱人軟骨糖蛋白39(YKL-40)，屬于糖苷水解酶18基因家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白[3]。CHI3L1在人體多種細(xì)胞中均有表達(dá)，具有參與炎癥、介導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤、分化和成熟以及促進(jìn)血管形成等作用[4]。研究表明CHI3L1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在胃癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]等多種腫瘤中均高表達(dá)，且提示患者預(yù)后不良。目前有關(guān)CHI3L1促進(jìn)腫瘤形成的機(jī)制尚未明了。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1在經(jīng)典型PTC中的表達(dá)，探討三者在經(jīng)典型PTC發(fā)生中的可能作用機(jī)制，旨在為經(jīng)典型PTC診斷、治療及評估預(yù)后提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1～12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的具有完整臨床和病理資料的經(jīng)典型PTC標(biāo)本114例，隨機(jī)抽取癌旁正常組織60例及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織60例。114例經(jīng)典型PTC中，男性23例，女性91例；≤45歲者52例，>45歲者62例；腫瘤直徑：直徑≤2 cm者65例，>2 cm且≤4 cm者27例，>4 cm者22例；腫瘤發(fā)生數(shù)：71例單發(fā)，43例多發(fā)；57例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，57例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期100例，Ⅲ+Ⅳ期14例。所有患者均于確診前未行放、化療等任何治療。病理診斷由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師共同閱片。

1.2 免疫組化所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，抗原修復(fù)，滴加一抗(CHI3L1或β-catenin或Cyclin D1)，滴加二抗，DAB顯色3～5 min，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。陰性對照以PBS代替一抗。以上實(shí)驗(yàn)方法按照EliVision plus法進(jìn)行。兔多克隆抗體CHI3L1購自美國Abcam公司(ab77528，稀釋比1 ∶1 000)，即用型單克隆抗體β-catenin(MX043)及單克隆抗體Cyclin D1(SP4)、EliVision plus試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 結(jié)果判定CHI3L1陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，即在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒。Cyclin D1陽性為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒。CHI3L1、Cyclin D1免疫組化結(jié)果判定均采用半定量積分法，包括染色強(qiáng)度和染色范圍兩部分。按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：>3分為陽性，≤3分為陰性。β-catenin結(jié)果判定參考Maruyama等[8]的標(biāo)準(zhǔn)。β-catenin正常表達(dá)為細(xì)胞膜陽性率>70%，其異常表達(dá)包括兩種情況：表達(dá)減弱或缺失為細(xì)胞膜陽性率<70%，異位表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核陽性率>10%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)分析CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1與臨床病理特征的關(guān)系，Spearman相關(guān)分析檢測CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中CHI3L1的表達(dá)正常甲狀腺組織中CHI3L1的陽性率為33.3%(20/60)，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中CHI3L1陽性率為38.3%(23/60)，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)典型PTC組織中CHI3L1陽性率(61.1%，70/114)高于正常甲狀腺和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A～C)。在經(jīng)典型PTC組織中，CHI3L1表達(dá)與瘤體大小、瘤體數(shù)目、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床pTNM分期密切相關(guān)(P<0.05，表1)。腫瘤瘤體越大、發(fā)生數(shù)目越多、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或pTNM分期越晚者CHI3L1陽性率越高。

2.2 經(jīng)典型PTC組織中β-catenin的異位表達(dá)在經(jīng)典型PTC組織中β-catenin異位陽性率(50.9%，58/114)高于正常甲狀腺組織(9.1%，5/60)和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織(10.0%，6/60)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1D～F)。腫瘤數(shù)目越多，β-catenin的異位陽性率越高(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組β-catenin異位陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；腫瘤分期越高，β-catenin異位陽性率越高(P<0.05)。β-catenin表達(dá)與患者年齡、性別、瘤體大小無相關(guān)性(表1)。

2.3 不同甲狀腺組織中Cyclin D1的表達(dá)Cyclin D1在經(jīng)典型PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的陽性率分別為58.8%(67/114)、16.7%(10/60)、13.3%(8/60)。經(jīng)典型PTC中Cyclin D1陽性率高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1G～I(xiàn))。腫瘤數(shù)目越多、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期越晚，Cyclin D1蛋白陽性率越高；Cyclin D1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、瘤體大小無相關(guān)性(表1)。

圖1 A～C.CHI3L1依次在PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達(dá),EliVision plus法；D～F.β-catenin依次在PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達(dá)，EliVision plus法；G～I(xiàn).Cyclin D1依次在PTC、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、正常甲狀腺組織中的表達(dá)，EliVision plus法

2.4 經(jīng)典型PTC組織中CHI3L1、β-catenin與Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CHI3L1表達(dá)與β-catenin、Cyclin D1表達(dá)均呈正相關(guān)(rs=0.735，rs=0.597，P均<0.05)，提示在經(jīng)典型PTC中CHI3L1蛋白高表達(dá)與β-catenin蛋白異位高表達(dá)或Cyclin D1蛋白高表達(dá)可以共同促進(jìn)。同時(shí)，在經(jīng)典型PTC中β-catenin蛋白異位高表達(dá)與Cyclin D1蛋白高表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.817，P<0.05，表2)，提示兩者可互相協(xié)同、共同促進(jìn)。

表2 經(jīng)典型PTC中CHI3L1、β-catenin及Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

2.5 生存分析Kaplan-Meier生存分析顯示，經(jīng)典型PTC患者的5年生存率達(dá)93.9%(107/114)，腫瘤數(shù)目(Log-rank=7.656，P=0.006)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Log-rank=6.611，P=0.010)，pTNM分期(Log-rank=31.975，P<0.001)、CHI3L1蛋白水平(Log-rank=4.717，P=0.030)、β-catenin蛋白異位表達(dá)(Log-rank=7.654，P=0.006)、Cyclin D1蛋白水平(Log-rank=4.976，P=0.026)與患者預(yù)后有相關(guān)性(P<0.05，圖2)，患者年齡、性別、腫瘤大小與患者預(yù)后無相關(guān)性(P>0.05)。

圖2 Kaplan-Meier法分析經(jīng)典型PTC患者預(yù)后相關(guān)因素：A.CHI3L1；B.β-catenin；C.Cyclin D1；D.腫瘤單發(fā)/多發(fā)；E.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；F.pTNM分期

3 討論

CHI3L1是一種幾丁質(zhì)酶樣蛋白，由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生[3]。Cheng等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CHI3L1蛋白在良性甲狀腺腫瘤中低表達(dá)或不表達(dá)，在不同分化惡性甲狀腺腫瘤中高表達(dá)，同時(shí)，CHI3L1蛋白表達(dá)水平越高提示患者年齡越大、甲狀腺組織外浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越高、pTNM分期越晚、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高，BRAF V600E突變頻率更高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)了在經(jīng)典型PTC中CHI3L1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。Luo等[10]指出在PTC中CHI3L1蛋白高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生侵襲密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著經(jīng)典型PTC瘤體的增大和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，CHI3L1蛋白表達(dá)水平越高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致[9-10]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤數(shù)目的增多，CHI3L1蛋白陽性率增高，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。有學(xué)者指出CHI3L1在腫瘤中表達(dá)上調(diào)可能與免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子、信號通路、氧化應(yīng)激或腫瘤微環(huán)境等相關(guān)[11-12]。Cheng等[9]首次通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過CYR61沉默或重組CYR61治療，可以逆轉(zhuǎn)CHI3L1調(diào)節(jié)的腫瘤細(xì)胞特性的改變，提示CYR61可能參與CHI3L1介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

β-catenin基因編碼β-連環(huán)蛋白，正常情況下定位于細(xì)胞膜，與鈣黏蛋白(E-cadherin)結(jié)合，共同維持細(xì)胞的完整性，參與細(xì)胞間的黏附[12-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin在經(jīng)典型PTC組織中異位高表達(dá)，且與腫瘤分期較晚及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示β-catenin的差異表達(dá)可促使經(jīng)典型PTC的發(fā)生、發(fā)展，可能因β-catenin在細(xì)胞膜的表達(dá)缺失造成腫瘤細(xì)胞間黏附性降低，腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后更差。在肝癌和子宮頸癌中的實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了β-catenin蛋白異位高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖[15-16]。Salim等[17]指出Wnt信號通路異常激活后，β-catenin無法被降解，導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中顯著聚集，甚至進(jìn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)或抑制下游因子，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。

Cyclin D1是細(xì)胞周期核蛋白家族成員之一，在正常情況下易被降解，在細(xì)胞內(nèi)一旦聚集，易造成細(xì)胞癌變，其參與多種腫瘤的發(fā)生[18]。由于其在癌組織中表達(dá)差異顯著，目前在臨床病理診斷鑒別中得到廣泛應(yīng)用，尤其在甲狀腺中聯(lián)合檢測Cyclin D1、CK19、CD56等可協(xié)助PTC的病理診斷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cyclin D1在經(jīng)典型PTC中高表達(dá)，其參與了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致[19-20]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，β-catenin與E-cadherin之間通過某些機(jī)制相互作用，可以促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá)上調(diào)，在細(xì)胞增殖分化中起重要作用[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示三者相互作用，共同促進(jìn)經(jīng)典型PTC的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、癌變[22]。Scully等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中通過過表達(dá)CHI3L1可以增加細(xì)胞的能動(dòng)性，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)減弱，從而加速腫瘤的進(jìn)展。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測CHI3L1表達(dá)上調(diào)可能通過降低E-cadherin的表達(dá)，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞膜中的穩(wěn)定性下降，從而出現(xiàn)異位表達(dá)，Wnt信號通路異常激活，作用于下游靶基因Cyclin D1，促使Cyclin D1異常高表達(dá)，導(dǎo)致經(jīng)典型PTC的發(fā)生。

本組Kaplan-Meier生存分析顯示，經(jīng)典型PTC患者5年生存率高達(dá)93.9%(107/114)，但仍有少數(shù)患者死亡，死亡患者體內(nèi)CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平明顯上調(diào)，提示CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白高表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。研究指出[9]CHI3L1過表達(dá)增加了甲狀腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)性。β-catenin在許多惡性腫瘤，如乳腺癌、子宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，且亦與患者不良預(yù)后相關(guān)[24-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本一致[9,24-27]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1可能相互作用，參與甲狀腺組織的癌變，促進(jìn)經(jīng)典型PTC的發(fā)生。因此聯(lián)合檢測CHI3L1、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平，可能會為經(jīng)典型PTC早期診斷及預(yù)后評價(jià)提供良好的候選基因。