時(shí)間分辨熒光免疫層析法測(cè)定糧食中的黃曲霉毒素B1

張少波 鄧常繼 張海濤 朱啟思

摘要：采用時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條及配套的熒光定量分析儀，對(duì)糧食中黃曲霉毒素B₁的快速檢測(cè)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.8 μg/kg，定量限為2.6 μg/kg，不同水平的加標(biāo)回收率在94%～108%。選取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)試，液相色譜法檢測(cè)結(jié)果與該方法結(jié)果基本一致。該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，適用于糧食中黃曲霉毒素B₁的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：時(shí)間分辨熒光免疫層析法;黃曲霉毒素B₁;糧食

中圖分類(lèi)號(hào)：TS210.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210618

我國(guó)糧食產(chǎn)量連續(xù)7年保持在6.5億t以上，實(shí)現(xiàn)糧食生產(chǎn)十八年連續(xù)豐收[1]。在糧食數(shù)量安全得到保障的前提下，糧食質(zhì)量安全越來(lái)越受到重視，消費(fèi)者對(duì)安全、健康、營(yíng)養(yǎng)糧食產(chǎn)品的訴求益加強(qiáng)烈。近年來(lái)，受天氣等環(huán)境影響，真菌毒素成為威脅我國(guó)糧食質(zhì)量安全的主要因素。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)[2]，我國(guó)每年因真菌毒素污染造成的糧食損失累計(jì)超過(guò)3 000 萬(wàn)t。

真菌毒素是真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[3]。致癌性是真菌毒素的主要危害，其中以黃曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁，AFB₁）致癌性最強(qiáng)，被國(guó)際癌癥研究所列為I級(jí)致癌物[4]。鑒于AFB₁的劇毒性和普遍性，早在2002年，國(guó)家質(zhì)檢總局規(guī)定小麥粉、玉米、食用油、醬油、醋5類(lèi)食品實(shí)行“市場(chǎng)準(zhǔn)入制度”，必須檢驗(yàn)AFB₁的含量[5]。近年，相關(guān)部門(mén)多次修訂真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格監(jiān)管。

AFB₁的檢測(cè)方法主要有免疫親和層析液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、膠體金法等。免疫親和層析液相色譜法是測(cè)定真菌毒素使用最為普遍的方法之一，但其操作周期較長(zhǎng)，需要用到的有機(jī)試劑較多、耗材較貴;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法所需設(shè)備更為昂貴，酶聯(lián)免疫法和膠體金法易受基質(zhì)干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性[6]。時(shí)間分辨熒光免疫層析法是近年發(fā)展較快的一種檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已在食品檢測(cè)行業(yè)得到應(yīng)用[7]。本文擬對(duì)該方法在稻谷、玉米等糧食樣品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步推廣使用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

SW-2型時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)儀、AFB1時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)卡：江蘇省蘇微微生物研究有限公司;AL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司;3310型盤(pán)式實(shí)驗(yàn)粉碎磨：波通瑞華科學(xué)儀器有限公司;Multi Reax型旋渦混勻器：德國(guó)Heidolph公司;MINI-7K型微型離心機(jī)：杭州米歐儀器有限公司;Milli-Q型超純水儀：美國(guó)密理博公司;20 ～ 200μL和100 ～ 1 000μL單道可調(diào)移液器：德國(guó)Eppendorf 公司。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司;AFB₁免疫親和柱、樣品稀釋液：江蘇省蘇微微生物有限公司;玉米全粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100386]、花生油中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100604]、糙米粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW （E）100607]及黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品[GBW（E）100302]：國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g粉碎樣品（稻谷樣品需壟谷）于50 mL離心管中，加入20 mL 70%甲醇水至離心管中，渦旋提取2 min，高速離心5 min，取上清液。

1.2.2樣品檢測(cè)

測(cè)試前，將未開(kāi)封的檢測(cè)卡及試劑平衡至25 ℃。將檢測(cè)卡平放，用移液器定量吸取100μL上清液加入900μL樣本稀釋液中，反復(fù)吸打5次以充分混勻，后再吸出100μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，室溫下反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)卡放入時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)儀中檢測(cè);在儀器感應(yīng)區(qū)中放置對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線智能卡，在主界面的“測(cè)量”菜單中點(diǎn)擊讀取智能卡后，點(diǎn)擊“樣品測(cè)量”進(jìn)行檢測(cè)儀器讀數(shù)完成后會(huì)自動(dòng)計(jì)算出被檢樣本中的AFB₁含量，可選擇儲(chǔ)存及打印結(jié)果。

1.2.3檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

（1）定量曲線：將AFB₁的標(biāo)準(zhǔn)品，用50% 甲醇水定容配制成1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;采用0.4% 的吐溫-PBS（pH 7.2，0.01 moL/L）稀釋成0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取100 μL加至層析卡的樣品孔中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)T 線熒光強(qiáng)度與C線熒光強(qiáng)度，計(jì)算T/C值。

（3）準(zhǔn)確度：按照1.2.1的前處理方法，在陰性稻谷樣品中分別加入10、20、60μg/kg的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定方法的加標(biāo)回收率。

式中：P為加標(biāo)回收率，%;c₁為陰性稻谷測(cè)定值，μg/kg;c₂為加標(biāo)稻谷測(cè)定值，μg/kg;c₃為加標(biāo)量，μg/kg。

（4）精密度：分別選擇低、中、高3種濃度的AFB₁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用不同批次的測(cè)試卡，10次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算批間和批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。

式中：CV為變異系數(shù)，%;SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差，ng/mL;MN為平均值，ng/mL。

（5）與國(guó)標(biāo)仲裁法的對(duì)比試驗(yàn)：取不同基質(zhì)不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，先用國(guó)標(biāo)仲裁法——免疫親和層析液相色譜法測(cè)定，再使用時(shí)間分辨

熒光免疫層析法測(cè)定，進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

2結(jié)果與討論

2.1定量曲線

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)試，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對(duì)數(shù)值（InC）為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T₀/C₀值的比值所得百分比為縱坐標(biāo)，得到一條平滑的S曲線，如圖1所示。

由圖1可以發(fā)現(xiàn)，在0.01 ～ 1.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，存在一段接近于直線的曲線，其線性方程為y = -15.704x + 23.702，相關(guān)系數(shù)R²= 0.994 8。由此，選定AFB₁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.01 ～ 1.0 ng/mL，并以AFB₁濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的T/C值為縱坐標(biāo)，建立定量曲線，結(jié)果如圖2所示。

2.2檢出限和定量限

由表1可知，本方法的檢出限和定量限分別為0.8、2.6 μg/kg，優(yōu)于GB 5009.22—2016第四法酶聯(lián)免疫吸附篩查法（方法檢出限為1 μg/kg，定量限為3 μg/kg）和LS/T 6111—2015膠體金定量檢測(cè)法（方法檢測(cè)限為2 μg/kg），滿足GB 2761—2017規(guī)定的糧食樣品AFB₁的限量要求。

2.3準(zhǔn)確度

對(duì)陰性稻谷樣品進(jìn)行3水平6平行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，本方法加標(biāo)回收率在94% ～ 108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，滿足檢驗(yàn)的要求。

2.4精密度

分別選擇0.025、0.1、1 ng/mL 3種濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.2的檢測(cè)方法，采用不同批次的測(cè)試卡重復(fù)試驗(yàn)10次，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，批內(nèi)CV值在7.44%～9.43%，小于10%;批間CV值在11.90% ～ 14.65%，小于15%，說(shuō)明該方法均一性良好。

2.5與國(guó)標(biāo)仲裁法的對(duì)比試驗(yàn)

分別采用液相色譜法和時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)玉米全粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、糙米粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、花生油中黃曲霉毒素B₁成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，在不同的糧食基質(zhì)中，時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)值與液相色譜法檢測(cè)值較為一致，均在所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值內(nèi)。

3結(jié)論

本文對(duì)時(shí)間分辨熒光免疫層析法在糧食樣品的黃曲霉毒素B₁檢測(cè)進(jìn)行了研究。該方法的檢出限為0.8 μg/kg，定量限為2.6 μg/kg，線性范圍為0.1 ～ 1 ng/mL，不同水平的加標(biāo)回收率在94%～108%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)（CV）分別在7.44% ～ 9.43%、11.90% ～ 14.65%，均小于15%。選取不同基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)試，本方法與液相色譜法檢測(cè)結(jié)果基本一致，在所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。上述結(jié)果說(shuō)明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足使用要求，且具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適用于玉米、稻谷等糧食的黃曲霉毒素B₁快速檢測(cè)。參考文獻(xiàn)

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Detection of AFB1 in Grain by the Time-resolved Fluoro-immunoassay

Zhang Shaobo1，Deng Changji2，Zhang Haitao3，Zhu Qisi1

（1. Guangdong Provincial Food and Strategic Reserves Assurance Center，Guangzhou，Guangdong 510050;

2. Guangdong Institute for Cereal Science Research，Guangzhou，Guangdong 510050;3. Jiangsu SUWEI Microbiology Research Co.，LTD，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract：This research used time-resolved fluoro-immunoassay strip and assorted time-resolved fluoro-immunoassay portable quick tester to detect aflatoxin B₁in grain. The assay showed that the limit of determination and the limit of quantification were 0.8 and 2.6 μg/kg，respectively. The recoveries of samples at different levels were rang between 94% to 108%. The results of the standard quality control sample had a good agreement with those of HPLC. This method was accurate，sensitive and convenient. It is suitable for the rapid screening of AFB₁in grain samples.

Key words：time-resolved fluoro-immunoassay，aflatoxin B₁，grain