分散液液微萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶飲料中黃曲霉毒素B1和B2

陳佩佩 陳琳珊 陳茹

摘 要：建立了分散液液微萃?。―LLME）-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對茶飲料中的黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2進行同時測定的方法。樣品以鹽酸為分散劑，3-氯苯胺為萃取劑進行萃取，調(diào)節(jié)pH至6后，離心分層，棄去上層水相，下層乙腈定容，使用電噴霧電離源正離子模式進行測定。結(jié)果表明，兩種黃曲霉毒素在1.0～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.999 3，平均回收率為71.2%～91.0%，檢出限均為20.0 ng/kg，定量限均為50.0 ng/kg，相對標準偏差為2.23%～6.43%。該方法操作快速簡便、回收率好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于日常測定茶飲料中的黃曲霉毒素。

關(guān)鍵詞：分散液液微萃取;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;茶飲料;黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的一類次生代謝物[1]，從化學結(jié)構(gòu)上，均屬于雙呋喃香豆素衍生物，是一類毒性極強的雙呋喃環(huán)類毒素。由于AFT產(chǎn)生菌在自然界中廣泛存在，很多的動植物源性食品都有可能存在污染[2]，尤其在植物的種植、加工、運輸、儲存等過程都有可能被產(chǎn)生菌污染，從而產(chǎn)生毒素[3]。同時，黃曲霉毒素在自然條件下穩(wěn)定性較強，極性較低，難以用水或紫外線完全除去，只有在強堿性條件下容易分解[4]，過多的攝入引起致癌、致畸和致突變等毒性效應[5]，其中以黃曲霉毒素B1的毒性致癌性最強。近年來，我國黃曲霉毒素污染事件頻繁發(fā)生，因此，建立高效、通用、靈敏的相關(guān)檢測方法，對企業(yè)生產(chǎn)，消費者安全都有十分重要的意義。

目前，國內(nèi)外對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]或液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[10]、免疫學檢測法[11-12]。高效液相色譜法操作煩瑣，盡管檢測器靈敏度高，但雜質(zhì)多，分析時間較長，免疫學檢測法雖然能大批量檢測，但易與類似結(jié)構(gòu)的化合物發(fā)生反應，出現(xiàn)假陽性，結(jié)果偏差較大。質(zhì)譜法應用較廣，前處理簡單，定性定量能力好，但高分辨質(zhì)譜價格昂貴，難以廣泛應用。本文以分散液液微萃取為前處理手段，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對茶飲料中的黃曲霉毒素B1和B2進行測定。方法學驗證結(jié)果表明，方法整體方便快捷，靈敏度高，回收率好，可日常大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

API4000Q質(zhì)譜儀、島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)、4k-15離心機、IKA Vortex4渦旋混勻器、Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)。

1.2 材料與試劑

茶飲料，廣州市售;黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2，純度大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷，均為HPLC級，美國Thermo Fisher公司;鹽酸、磷酸鈉，均為分析純，廣州試劑廠;實驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 樣品前處理

于15 mL尖底離心管中加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混勻，然后加入5 mL樣品，渦旋提取10 min，使用1 mol/L的磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6，渦旋混勻后置于離心機中以4 500 r/min離心5 min，使3-氯苯胺沉淀。除去上層水相，下層3-氯苯胺用乙腈定容至

200 μL，待測定。

1.4 標準曲線的繪制

標準儲備溶液：分別準確稱取黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2標準品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈稀釋成500 mg/L的儲備液。

標準中間溶液：用乙腈將上述儲備液稀釋成濃度為10 mg/L的標準中間液。

溶劑曲線：使用乙腈配制成1.0 ?g/L、2.0 ?g/L、5.0 ?g/L、10 ?g/L、20 ?g/L、50 ?g/L和100 ?g/L的標準使用液，繪制校準曲線。

基質(zhì)曲線：使用空白烏龍茶基質(zhì)液配制校準曲線，濃度點與溶劑曲線相同。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.0 ?m）;進樣體積：10 ?L;流速0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）;等度洗脫程序：0.0～5.0 min，75% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源;離子化模式：電噴霧電離源正模式（ESI+）;氣簾氣壓：241 kPa;毛細管電壓：5 500 V;離子源溫度（TEM）：550 ℃;霧化氣壓力：345 kPa;加熱輔助氣壓力：345 kPa;碰撞氣（CAD）：中等;采集模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性定量分析依據(jù)的收集

根據(jù)黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的化學結(jié)構(gòu)，其含有較多含O基團，在離子化過程中傾向于得到質(zhì)子，因此分別以其相對分子質(zhì)量加上H+質(zhì)量，初步確定母離子質(zhì)荷比。以混合流動相的流動注射的方式向離子源注射標準溶液，在m/z 313.1和m/z 315.1處，均得到較高響應的[M+H]+離子，同時以多反應監(jiān)測（MRM）模式采集二級碎片。進一步優(yōu)化去簇電壓DP和碰撞電壓CE，得到較優(yōu)響應，二級質(zhì)譜圖見圖1，詳細質(zhì)譜信息見表1。

2.2 分散劑的選擇

分散液液微萃取過程中，加入分散劑和待測樣液互溶，加入萃取劑振蕩形成微小的液滴，這些液滴在移動的過程中于對目標物進行連續(xù)萃取，形成水/分散劑/萃取劑形成均相乳濁液體系，快速完成分析物在水溶液與萃取劑之間的分配平衡。選擇鹽酸作為分散劑。在本實驗中，當分散劑用量小于0.6 mL時，提取回收率低于70%，使用量為1.0 mL時，回收率達到最高，隨著使用量提高至1.2 mL，回收率有所回降。所以鹽酸分散劑用量選取為1.0 mL。詳細結(jié)果見圖2。

2.3 萃取劑體積的選擇

在分散劑體積為1 mL的條件下，分別用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺進行萃取，考察了不同體積的萃取劑對萃取回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著3-氯苯胺體積增大，回收率也增大，而當體積大于50 μL時，回收率增大不明顯，而且3-氯苯胺的使用體積越大，pH回調(diào)的幅度也越大，實驗更耗時，最終定容液3-氯苯胺的占比也越大，對于含有甲酸的流動相體系，容易造成溶劑效應，使峰型變差。因此，最終確定3-氯苯胺50 μL為最佳萃取體積。

2.4 基質(zhì)效應的探討

市售的茶飲料會添加糖、色素、酸度調(diào)節(jié)劑或其他添加劑，且含量遠超于黃曲霉毒素可能存在的含量，加上茶葉本身含有較多的天然物，因此有可能造成較嚴重的基質(zhì)效應（ME），使定量結(jié)果偏差較大。為了探究實驗實際存在的基質(zhì)效應，分別用空白基質(zhì)液和乙腈配制了基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€，并以基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€的斜率比ME值為判斷依據(jù)，當ME在80%～120%時，則說明基質(zhì)效應不明顯。實驗結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的ME值分別為23.2%和26.5%，說明基質(zhì)負效應明顯，因此最終選擇使用基質(zhì)曲線進行定量，以校正基質(zhì)效應造成的偏差。

2.5 定量分析結(jié)果

使用空白基質(zhì)溶液配制標準曲線，線性范圍為1.0～100 ?g/L，將該曲線于優(yōu)化后的條件下測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。同時以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分別確定方法的檢測限與定量限。黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2定量離子流圖見圖4。

結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B2的相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 6和0.999 3，基質(zhì)曲線方程分別為Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750，檢測限均為20.0 ng/kg，定量限均為50.0 ng/kg。由分析結(jié)果可知，本方法定量能力好，檢出限低，可有效對茶飲料中的黃曲霉毒素進行定量分析。

2.6 回收率及精密度分析

分別對市售的3種茶飲料（綠茶、烏龍茶、紅茶）進行測定，結(jié)果均為陰性。使用該樣品進行加標回收實驗。每種樣品均按照定量限的1倍、2倍和10倍進行添加，即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg濃度水平，每個濃度水平在日內(nèi)平均測定6次，平均回收率和相對標準偏差結(jié)果見表2。

3種樣品的平均回收率范圍在71.2%～91.0%，RSD范圍在2.23%～6.43%，方法回收率、精密度及準確度良好，可用于實際樣品的測定。

3 結(jié)論

以液液微萃取為基礎，建立前處理方法，方法整體高效簡單，通過調(diào)節(jié)pH，較大限度回收萃取劑，提高了回收率;建立UPLC-MS/MS法，優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜條件，兩種黃曲霉毒素在樣3 min內(nèi)出峰，且峰型良好。使用基質(zhì)曲線對定量結(jié)果進行校準，降低了基質(zhì)效應對結(jié)果的影響?；厥章屎拖鄬藴势顢?shù)據(jù)表明，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，可為茶飲料中毒素測定方法的開發(fā)提供

依據(jù)。

參考文獻

[1]潘中華，徐燕芳，成恒嵩.黃曲霉毒素分析方法進展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展，1995，12（2）：30-33.

[2]趙亞榮，劉香香，趙曉麗，等.生姜及其制品中常見真菌毒素污染與檢測方法研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2020（4）：49-54.

[3]NAIR K P P.The Postharvest and industrial processing of ginger [M].Oxford： Elsevier，2013.

[4]楊惠宇，趙瑩，潘發(fā)林.魚類飼料中黃曲霉毒素B1檢測技術(shù)研究進展[J].河北漁業(yè)，2020（8）：52-55.

[5]OMOTAYO O P， OMOTAYO A O， BABALOLA O O， et al. Dataset on the toxic effects of aflatoxin and ochratoxin A on the human gastric smooth muscle cells[J].Data in Brief， 2019，25：104089.

[6]華麗霞，曾華蘭，蔣秋平，等.免疫親和凈化-光化學衍生液相色譜檢測不同樣品中的黃曲霉毒素[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2020，22（7）：181-187.

[7]石格鑫.高效液相色譜法測定小麥中黃曲霉毒素B1含量[J].現(xiàn)代食品，2020（10）：204-206.

[8]孫夏榮，葛曉明，王建花.QuEChERS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中藥飲片中黃曲霉毒素[J].中國藥業(yè)，2020，29（11）：44-47.

[9]華宇，高和楊，聶興娜，等.同位素內(nèi)標-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶及奶粉中黃曲霉毒素M1[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2020，11（6）：1978-1984.

[10]姚婷，王丹，李雙，等.超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法快速檢測發(fā)酵黑茶中黃曲霉毒素B1[J].分析測試學報，2017，36（11）：1346-1351.

[11]Iqbal J， Asghar M A， Ahmed A， et al. Aflatoxins contamination in Pakistani brown rice： a comparison of TLC， HPLC， LC-MS/MS and ELISA techniques[J]. Toxicol Mech Method， 2014，24（8）：544-551.

[12]Juki H， Dedi S， Rodi M， et al. Determination of Aflatoxin M1 in Raw Milk by the ELISA Method in the Una-Sana Canton[M]. 30th Scientific-Experts Conference of Agriculture and Food Industry，2020.