基質金屬蛋白酶2、血管內皮生長因子在膽囊癌中的表達及與患者預后的關系

田德福，吳宏，楊洲明

1陜西省第四人民醫院普外科，西安 710043

2陜西省西電集團醫院普外科，西安 710074

膽囊癌指膽囊組織出現的惡性病變，且多發生于膽囊底部、體部、頸部及膽囊管。膽囊癌作為臨床常見的消化系統惡性腫瘤之一，其發病率居消化系統惡性腫瘤的第5 位，但膽囊癌的臨床癥狀缺乏特異性，早期診斷較為困難，一經確診惡性程度就已經較高，增加了膽囊癌患者的臨床治療難度，降低了患者的生存率，增加了患者及家屬的精神及經濟壓力。腫瘤細胞的遷移、侵襲可影響患者的預后及治療效果，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可有效促進內皮細胞和腫瘤新生血管生成，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成員MMP2 可降解細胞外基質，增強了細胞浸潤過程中突破細胞外基質的能力。本研究探討MMP2、VEGF 在膽囊癌患者中的表達及與患者預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2017 年12 月陜西省第四人民醫院和陜西省西電集團醫院收治的膽囊癌和膽囊息肉患者。納入標準：①手術病理活檢確診為膽囊癌或膽囊息肉；②均為首次確診，入院后均接受根治性手術治療；③術前無相關抗腫瘤藥物使用史；④未接受腫瘤相關放療、化療等治療。排除標準：①合并一定程度的肝臟系統疾病（肝炎、肝硬化等）；②合并呼吸、循環等系統病變，存在一定程度的腦血管疾病；③合并精神系統疾病，無法正常交流；④病歷資料不完整。依據納入和排除標準，本研究共納入96 例膽囊癌患者和96 例膽囊息肉患者。膽囊癌患者中男52 例，女44 例；年齡60～79 歲，平均（71.4±4.02）歲；美國癌癥聯合委 員 會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7 版TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期36 例，Ⅳ期4 例；分化程度：低分化17 例，中分化30 例，高分化49 例：病理類型：腺癌81 例，鱗狀細胞癌15 例；淋巴結轉移56 例，無淋巴結轉移40例；浸潤深度：淺肌層35 例，深肌層43 例，全肌層18 例。膽囊息肉患者中男63 例，女33 例；年齡60～79 歲，平均（72.0±3.16）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清MMP2、VEGF水平

術前1 天及術后1 周，取兩組患者空腹靜脈血2 ml置于抗凝管內，靜置2 h，1000 r/min離心20 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA 檢測兩組患者血清MMP2、VEGF、VEGFC 受體VEGFR3（Flt4）水平，按照說明書要求進行標準品的稀釋及加樣、孵育，并采用酶標儀在450 nm 處檢測光密度值（optical density，OD），計算樣本濃度。

1.3 免疫組化法檢測不同組織中MMP2、VEGF 蛋白表達情況及結果判定

取膽囊癌患者的膽囊癌組織和膽囊息肉患者的膽囊息肉組織，切片，室溫脫蠟，予以適量的2%過氧化氫清除內源性過氧化物酶，經過微波修復處理，予以適量的5%山羊血清封閉處理，加入一抗（MMP2、VEGF），4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育10 min，再予以適量的二氨基聯苯胺溶液染色。結果判定：VEGF 定位于細胞質或細胞膜，每個視野下10%以上膽囊癌細胞質（或細胞膜）呈棕黃染色判定為陽性。MMP2定位于細胞質，以視野中細胞質呈棕色或褐色染色，且著色程度明顯重于背景色，判定為陽性，僅對呈陽性表達的細胞進行最終的計數（間質染色除外）。根據染色強度和陽性細胞所占比例進行評分：依據染色強度評分，未著色計0 分、著色弱計1 分、中等著色計2 分、著強色計3 分；依據陽性細胞所占比例評分，陽性細胞所占比例為1%～25%計0 分、陽性細胞所占比例為26%～50%計1分、陽性細胞所占比例＞50%計2分。將染色強度和陽性細胞比例評分相加，0～2 分判定為MMP2、VEGF 蛋白表達陰性，3～5分判定為MMP2、VEGF蛋白表達陽性。

1.4 隨訪

膽囊癌患者術后，采用電話、門診隨訪等方式進行為期3 年的隨訪，隨訪截止時間為2020 年12月，記錄膽囊癌患者的生存情況。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比較

術前1 天，觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4水平均明顯高于對照組患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。術后1 周，兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯低于本組術前1 天，且觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯高于對照組患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 手術前后兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比較

2.2 不同組織中MMP2、VEGF蛋白表達情況的比較

膽囊癌組織中MMP2 蛋白的陽性表達率為64.58%（62/96），明顯高于膽囊息肉組織的35.42%（34/96），差異有統計學意義（

χ

=16.333，

P

=0.000）；膽囊癌組織中VEGF 蛋白的陽性表達率為42.71%（41/96），明顯高于膽囊息肉組織的0%，差異有統計學意義（

χ

=52.133，

P

=0.000）。（圖1）

圖1 膽囊癌組織和膽囊息肉組織中MMP2、VEGF蛋白表達情況（免疫組化染色，×400）

2.3 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白表達情況的比較

不同性別、病理類型膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。隨著浸潤深度的加深，膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白陽性表達率逐漸升高，差異均有統計學意義（

χ

=12.409、21.751，

P

＜0.05）；TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2 蛋白陽性表達率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和分化程度為中高分化的患者，差異均有統計學意義（

χ

=9.383、32.752、5.052，

P

＜0.05）；TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中VEGF蛋白陽性表達率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和分化程度為中高分化的患者，差異均有統計學意義（

χ

=37.825、16.082、22.852，

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF蛋白陽性表達情況的比較

2.4 生存情況的比較

隨訪3 年，MMP2 陽性表達膽囊癌患者3 年內復發轉移4 例，病死22 例；MMP2 陰性表達膽囊癌患者3 年內復發轉移1 例，病死4 例；MMP2 陽性表達膽囊癌患者3 年生存率為64.52%（40/62），低于陰性表達患者的88.24%（30/34），差異有統計學意義（

χ

=5.572，

P

=0.018）。VEGF 陽性表達患者3 年內復發轉移3 例，病死20 例；VEGF 陰性表達膽囊癌患者3 年內復發轉移1 例，病死2 例；VEGF 陽性表達膽囊癌患者3 年生存率為51.22%（21/41），明顯低于VEGF 陰性表達患者的96.36%（53/55），差異有統計學意義（

χ

=27.100，

P

=0.000）。

3 討論

腫瘤的發生發展過程受多個層級、多個環節的共同調控，是一種比較復雜的生物學行為表達的過程，且腫瘤細胞具有局部浸潤、轉移能力，監測腫瘤細胞侵襲、轉移過程中腫瘤標志物的表達情況，能有效預測腫瘤及患者的預后。

本研究結果顯示，術后1 周，兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯低于本組術前1 天，且觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯高于對照組患者，表明手術可在一定程度上維持患者體內VEGF、Flt4、MMP2 的平衡，觀察組患者術后雖然存在一定程度的下降，但仍始終高于對照組患者，表明VEGF、Flt4、MMP2 可能與膽囊癌有一定關聯。因此，本研究進一步探討MMP2、VEGF 表達情況與膽囊癌的關系發現，膽囊癌患者通過手術切除病變組織，可在一定程度上減輕膽囊癌細胞的侵襲、浸潤及轉移，同時，MMP2 的高表達可降解細胞基質膜及相關結構，從而促進惡性腫瘤細胞表達多種惡性生物學信息，促進下游因子VEGF 的表達，刺激內皮細胞增殖，增加血管通透性，促進血管內皮細胞的生成；而VEGF 在血管內皮細胞中高表達可與特異性受體Flt4 結合，促進局部組織內VEGF 的表達，從而促使腫瘤細胞向淋巴遷移及自身的生長及轉移。本研究結果顯示，隨著浸潤程度的加深，MMP2、VEGF 水平逐漸升高，TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF蛋白陽性表達率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和分化程度為中高分化的患者，與王紹勇和鄧小凡的研究結果一致。

本研究結果顯示，隨訪3 年，MMP2 陽性表達膽囊癌患者3 年生存率為64.52%，低于MMP2 陰性表達患者的88.24%，VEGF 陽性表達膽囊癌患者3年生存率為51.22%，低于VEGF 陰性表達患者的96.36%。這可能是因為腫瘤細胞不同的浸潤深度及分化程度使MMP2、VEGF 的表達存在差異，且隨著腫瘤細胞浸潤肌層程度的加深，TNM 分期的增大、分化程度的降低，均可導致MMP2、VEGF 的表達上調。此外，存在淋巴結轉移的膽囊癌患者膽囊癌組織MMP2、VEGF 陽性表達率升高，表明膽囊癌發展程度越高，腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲情況越明顯，腫瘤細胞遷移和浸潤能力的增強還可促使腫瘤新生血管內MMP2、VEGF 蛋白的表達，從而促使膽囊癌細胞間質血管網及淋巴管的大量產生，可促進腫瘤細胞進一步向淋巴管轉移，不同分化程度膽囊癌患者MMP2、VEGF 的差異，可以作為腫瘤患者病情嚴重程度的監測指標，同時也對預測腫瘤患者的預后有重要意義，與Zhao等的研究結果一致。

綜上所述，膽囊癌患者血清MMP2、VEGF、Flt4 的表達水平較高，且MMP2、VEGF 蛋白的表達情況對膽囊癌患者的預后有一定的預測價值，其陽性表達患者預后較差。