倒卵葉五加藥材的基原鑒定研究

趙新禮 舒泉湧 崔蕾 朱愛華

摘要 [目的]應用DNA條形碼鑒定技術對短柄五加等五加屬植物進行研究，以弄清倒卵葉五加和短柄五加的物種關系。[方法]通過對館藏標本與現地植物形態進行觀測，采用通用引物 ITS2 和 psbA-trnH對采自陜甘寧地區的短柄五加等50個樣本進行擴增后雙向測序，并從GenBank數據庫下載了五加屬等相關植物的序列，分別通過ITS2 database或其序列注釋，獲得ITS2和psbA-trnH序列，隨后進行BLAST比對鑒定分析;用MEGA 6.06軟件對所得序列進行比對，分析變異位點，計算GC含量、種內和種間遺傳距離，構建NJ系統發育樹。[結果]ITS2 和 psbA-trnH 序列的 PCR 擴增和測序成功率均為100%;倒卵葉五加和短柄五加的植物形態、ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同。ITS2 序列：短柄五加和糙葉五加僅有一個堿基的差異，蜀五加與藤五加序列相同;psbA-trnH 序列：短柄五加與糙葉五加的差異顯著，短柄五加與蜀五加序列相同。[結論]同時使用ITS2、psbA-trnH這2個標記的DNA 條形碼可以準確鑒別短柄五加等五加屬植物;短柄五加與倒卵葉五加為同一種植物。

關鍵詞 倒卵葉五加;短柄五加;基原鑒定;DNA條形碼;ITS2;psbA-trnH

中圖分類號 R 282.5 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0166-07

Abstract [Objective]The molecular identification technique of DNA barcode was used to identify the species of several plants of ?Eleutherococcus ?Maxim. in order to understand the relationship between ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus obovatus . [Method]By observing the morphology of collection specimens and onsite plants， using universal primers ITS2 and psbAtrnH， 50 samples including ?Eleutherococcus brachypus ?collected from Shaanxi， Gansu and Ningxia were amplified and sequenced in both directions，and downloaded the sequence of Araliacea and other related plants from GenBank database， obtained ITS2 and psbAtrnH sequence through ITS2 database or its sequence annotation， and then performed BLAST comparison and identification analysis.MEGA 6.06 software was used to compare the obtained sequences， analyze the mutation sites， calculate the GC content， intra and interspecies genetic distance， and construct the NJ phylogenetic tree.[Result]The success rate of PCR amplification and sequencing of ITS2 and psbAtrnH was 100%.The plant morphology， ITS2 sequence and psbAtrnH sequence of ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus obovatus ?were identical. ITS2 sequence： ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus henryi ?had only one base difference， and the sequence of ?Eleutherococcus leucorrhizus ?var. ?setchuenensis ?was the same as that of ?Eleutherococcus leucorrhizus .The sequence of psbAtrnH： ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus henryi ?sequence were significantly different， and the sequence of ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus leucorrhizus ?var. ?setchuenensis ?was the same.[Conclusion]At the same time， using ITS2 and psbAtrnH genetic markers， DNA barcode technology can accurately identify the 4 species of ?Eleutherococcus ?Maxim.; ?E. brachypus ?and ?E. obovatus ?should be the same plant.

Key words ?Eleutherococcus obovatus;Eleutherococcus brachypus ;Base source identification;DNA barcoding;ITS2（internal transcribed spacer 2 sequence）;psbAtrnH（psbAtrnH intergenic spacer sequence）

基金項目 陜西省科技統籌創新工程項目（2016KTTSSF 01-01-02）;陜西省咸陽市重大科技專項（2014K 01-17）。

作者簡介 趙新禮（1961—），男，陜西扶風人，主任藥師，從事中藥資源與栽培及分子生物學研究。

收稿日期 2021-01-27

倒卵葉五加與著名的中藥材刺五加具有相似的化學成分和藥理作用[1-2]，倒卵葉五加與短柄五加兩者分布區域重疊，植物形態高度相似，在其產區內均作為倒卵葉五加藥材使用，究竟兩者為同一種植物還是2種植物長期以來存在爭議[3-5]。自20世紀80年代倒卵葉五加被開發以來，由于無節制的采集使資源量銳減，為保證用藥的安全性和有效性，以及其野生撫育與栽培物種的準確性，有必要對該中藥材的基原進行鑒定研究。

傳統的中藥材基原鑒定即依據其植物形態學和分類學原理，根據形態鑒別特征，確定到物種的生物學名，這種鑒定方式受到鑒定人員知識和經驗等因素的影響，具有一定的局限性。DNA條形碼技術是利用基因組中一段或幾段公認的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，以自身在物種種內的特異性和種間的多樣性而創建的分子鑒定技術，可以對物種實現準確、快速、簡便的鑒定，不受發育階段、供試部位、環境條件等的限制，彌補了傳統鑒定方法在這方面的不足。

陳士林等[6]通過對大量中藥材進行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心、psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系，并將該方法納入2015年版《中國藥典》。ITS2序列是去除5.8S和28S rRNA基因序列的核糖體DNA序列間隔區，psbA-trnH序列是位于葉綠體編碼光合系統D1蛋白的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因之間的一段非編碼區，兩者均具有進化速率快、引物通用性好、片段足夠短、易擴增與測序的優點，已廣泛用于人參屬[7]、忍冬屬[8]、枸杞屬[9]、益母草[10]、覆盆子[11]、商陸[12]、活血丹[13]、金叉石斛[14]等藥材基原物種鑒定，五加皮[15]、竹節參[16]、當歸[17]等中藥材真偽鑒別，人參[18]、西洋參[18]、蒼術[19]等中藥材種子種苗的鑒定。

該研究采用植物形態鑒定與DNA條形碼分子鑒定技術相結合，利用通用引物ITS2和psbA-trnH序列對五加屬短柄五加等4種植物的50份標本進行鑒定分析，結合GenBank數據庫中的近緣物種序列構建系統進化樹，弄清倒卵葉五加和短柄五加間的物種關系，為倒卵葉五加藥材DNA條形碼鑒定方法的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

1.1.1.1 館藏標本。西北農林科技大學和陜西中藥研究所館藏的倒卵葉五加和短柄五加標本。

1.1.1.2 現地調查。對陜西、甘肅、寧夏的16個區縣進行五加資源野外調查、采集標本與分析樣品（表1）。標本經西北農林科技大學吳振海高級實驗師鑒定，現存放在陜西中藥研究所標本室。

1.1.1.3 樣品采集。每個區縣選取2～4個五加居群，在每個居群內選取相距2 m以上的10個植株，每株采集嫩葉一片放入自封袋內，加入硅膠快速干燥。待葉片徹底干燥后存放于-40 ℃的冰箱中備用。

1.1.1.4 五加屬等物種的ITS2和psbA-trnH序列。五加屬等物種的ITS2和psbA-trnH序列均來源于GenBank數據庫（表2）。

1.1.2 試劑。

DNA Marker、植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化）;Tris、EDTA、冰乙酸、瓊脂糖等（西安海默生物）;DNA凝膠回收試劑盒（北京擎科新業生物）;Prime STAR HS DNA Polymerase（Takara，美國）。

1.1.3 儀器。

高速冷凍離心機（eppendorf 5810R，德國）;PCR擴增儀（Life，美國）;制冰機（IMS-50，西安儀創）;電泳儀（JUNYI-300，北京君意）;凝膠成像儀（SAGECREATION，北京賽智）;基因測序儀器（ABI 3730，美國）。

1.2 方法

1.2.1 植物標本鑒定。依照植物的形態特征，參考文獻資料，按傳統方法進行鑒定[4]。

1.2.2 DNA提取。用干凈的剪刀將試樣剪碎，混勻，稱取適量，用植物基因組DNA提取試劑盒依照說明書提取，提取液 -20 ℃ 保存。

1.2.3 引物。參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[20]，由北京擎科新業生物技術有限公司合成（表3）。

1.2.4 PCR擴增及測序。

1.2.4.1 擴增體系。DNA模板1 μL，5X Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，引物1與引物2各1 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase ?0.25 μL，ddH2O 14.75 μL補足至 25 μL。

1.2.4.2 擴增程序。94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 35 s，33 個循環;72 ℃ 5 min，16 ℃停止。

1.2.4.3

PCR產物電泳及DNA純化回收。PCR產物經15%的瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段割膠，并使用DNA凝膠回收試劑盒按說明書進行DNA片段的純化回收。

1.2.4.4

DNA序列的測序。將純化的產物送北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。

1.3 數據處理

用Chromas軟件對測序所得到的峰圖進行人工校對;用CodonCode Aligner V6.0.2軟件進行拼接。ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法采用ITS2 database網站（http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）進行序列注釋，去除兩端的5.8S rRNA和28S rRNA區段，獲得完整的ITS2序列。根據GenBank數據庫中同屬物種psbA-trnH的注釋，去除序列兩端的psbA和trnH基因，獲得完整的psbA-trnH基因間隔區序列。用MEGA 6.06軟件進行序列對比，分析變異位點，計算GC含量，用Kimura 2-Parameter（K2P）法將所有數據計算種內和種間遺傳距離，用NJ鄰接法（Neighbour 2 Joining Method，NJ）將比對過的序列分別構建成五加屬植物的ITS2、pbsA-trnH序列的系統發育樹，各個分支的支持率使用bootstrap重復1 000次進行檢驗。最終將獲得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行樣品序列的BLAST（basic local alignment search tool）用最高相似搜索法進行確認比對分析。

2 結果與分析

2.1 植物形態鑒定

對館藏的倒卵葉五加和短柄五加標本進行了仔細觀測比對，未發現兩者的顯著區別。

2018年7—8月到陜甘寧地區的16個區縣，對50個五加居群進行野外調查，采集標本與分析樣品。采集的標本經鑒定，其中倒卵葉五加和短柄五加共42份，均鑒定為短柄五加;藤五加2份;蜀五加4份;糙葉五加2份。調查發現倒卵葉五加藥材的混淆品有藤五加和蜀五加（甘肅）、糙葉五加（陜西隴縣）。

倒卵葉五加藥材主產地的人們對其原植物短柄五加的叫法不一，如在陜西的旬邑、黃陵、黃龍、寶塔區、志丹、隴縣，甘肅的華池、合水、正寧、靈臺等地稱倒卵葉五加或倒刨牛;在宜君、甘泉、涇源、清水、崆峒區等地稱短柄五加或甘肅刺五加，其植物特征為：直立灌木，莖圓柱形，多分枝，株高0.5～3.0 m。在灌叢的頂部常生出向上的長枝與側生出短枝，下部老枝及根莖發出的枝條全為長枝;幼枝無毛，葉柄的基部常生1～2個刺，細長，下彎，基部不膨大。掌狀復葉，小葉通常5枚;在長枝上葉互生，在短枝上葉簇生;幼枝的上部總葉柄無或極短，無毛，無刺;從枝頂15～45 cm往下，總葉柄漸長，達2～12 cm，具縱棱。從灌叢枝條上端側生的短枝上，葉近于無柄，無毛，無刺，小葉亦較小，常數片簇生。小葉片薄紙質，倒卵形、倒卵狀長圓形，稀菱形，葉尖圓形或短尖，基部狹尖，楔形，兩面均無毛，邊緣近全緣或上部邊緣具數對鈍形齒牙;側脈3～5對。傘形花序單生或數個形成圓錐花序頂生于枝端，徑1～4 cm，有花多數。總花梗長1～8 cm，具縱棱，無毛，無刺;花梗細長，長0.6～2.0 cm，無毛。由于受生長環境的影響，植株間在形態上有少許差異，如短枝上或光照不好的情況下傘形花序較小、總花梗較短，長枝上或光照較好時傘形花序較大，花梗也較長;花淺黃綠色。苞片卵形，紫色，長約1 mm，先端叢生銹毛，邊緣疏生纖毛;花萼無毛或有短柔毛，邊緣具5個三角形小裂齒。花瓣5枚，三角狀卵形，先端尖，無毛，長約2 mm，開花時反曲。雄蕊5個，花絲長約2 mm。花柱5個，全部合生成柱狀。子房5室。果實橢圓狀球形，未成熟時綠色、綠黑色、黑色，成熟后黑紫色，直徑5～8 mm，風干時有5棱，宿存花柱長1.5～2.0 mm。花期7—8月。

2.2 PCR擴增結果

所有五加樣本ITS2序列與psbA-trnH序列PCR擴增均在序列長度500～750 bp出現一條清晰的DNA條帶（圖 1）。

2.3 序列測定結果

2.3.1

ITS2序列。ITS2引物的擴增效率和測序成功率均為100%。短柄五加等樣本經ITS2 ?F/R引物擴增后得到一段長455～498 bp的序列，去掉兩端的5.8S和28S區段后，獲得的ITS2序列長度為229～230 bp，GC含量為62.6%～63.0%。經兩頭等齊對比，短柄五加在序列18位有一個C的缺失;糙葉五加與短柄五加相比在18位多一個C;藤五加與蜀五加的ITS2序列完全相同，與短柄五加相比在18位多一個C，在24位發生T/A的轉換，在25位發生G/T的顛換。

短柄五加ITS2序列：

1 CGCATCGCGT CGCCCCC-AA CCCTGCACTC CCTCATGGGA GTCATGACTG

51 AGGGGCGGAT ACTGGCCTCC CGTGTCTCAC CGCGCGGTTG GCCCAAATGT

101 GAGTCCTTGG CGACGGACGT CACGACAAGT GGTGGTTGTA AAAAGCCCTC

151 TTCTCCTGTC GTGCGGTGGC CCGTCGCCAG CAAAAGCTCA TGTGACCCTG

201 TTGTGCCGTC CTCGACGAGC ACTCCGACCG

2.3.2

psbA-trnH序列。psbA-trnH引物的擴增效率與測序成功率均為100%。短柄五加等樣本經psbA-F/trnH-R引物擴增得到一段長487～522 bp的序列，去掉兩端的psbA和trnH基因后，獲得的psbA-trnH序列長度為392～399 bp，GC含量為28.3%～28.6%。psbA-trnH序列分別在短柄五加、蜀五加和糙葉五加種內變異位點數差異為0，在藤五加種內有一個變異位點的差異。短柄五加、蜀五加及甘肅清水產的藤五加三者psbA-trnH序列完全相同，甘肅清水產藤五加以3葉為主，少5葉;陜西隴縣產的藤五加全為3葉，與短柄五加相比在290位有一個G/C轉換。糙葉五加與短柄五加相比分別在149、294、397位有T/G、A/G、G/A的顛換，在132～133、393位發生AA/TT、C/G的轉換，在154～155位發生AT的缺失，在330～338位有一個CATAAGAAA序列片段的插入。

短柄五加psbA-trnH 序列：

1 GACCCGGTCT TAGTGTATAC GAGTTTTTTT GAAATAAAAA GGAGCAATAA

51 CCTCTTTCTT GTTCTATCAA GAGGGCGGTA TTGCTCCTTT TTTTATTTAG

101 TAGTATTTGT ACTTACCTAG TTTCTTTAAA TTTATTTAAA GAAACGTCGT

151 TTTATTTTTA TTGGTTGGTT CATGAGTGAG TATCATGCTT TCGTTCTGTA

201 TTAATCATTA ATCTAGAATT TAGCTACTTC TTCCCAATCT TTTGGGAAGT

251 ATTTTTTAAA AAGAAAAGAT AAAAATGTTG GACTTTTTAC TTAGTTAATA

301 CTTAATATTT TTATCTCGAA AATAAGAAAG AAATAATGAT GAATGGTAAA

351 AGTTTAATCT TTTGAAACGT AAGGAAAAGA ATAGTAGAGG GG

2.4 五加屬植物ITS2序列的差異與遺傳距離分析

五加屬植物的ITS2序列長度為229～231 bp，GC含量61.1%～641%。當空位（gap）作為缺失處理時，序列兩端對齊比對，屬內保守位點210個，變異位點21個，簡約信息位點8個，自裔位點13個（表4）。短柄五加、糙葉五加、藤五加和蜀五加的ITS2序列在種內完全相同，種內遺傳距離均為0。屬內種間遺傳距離為0.000～0.055，平均為0.020。短柄五加和糙葉五加與紅毛五加間的遺傳距離為0;藤五加與蜀五加間的遺傳距離為0，刺五加與無梗五加間的遺傳距離為0;烏蘞莓五加與狹葉五加間的遺傳距離為0。可見ITS2序列在同物種之間高度保守，同屬不同種間、種內變種之間遺傳距離差異有時不明顯，因此，ITS2序列只能作為鑒別五加屬物種的依據之一。

2.5 五加屬植物psbA-trnH序列的差異與遺傳距離分析

五加屬植物的psbA-trnH序列長度為392～399 bp，GC含量27.4%～28.8%。當空位（gap）作為缺失處理時，序列兩端對齊比對（401 bp），屬內保守位點387個，變異位點14個，簡約信息位點11個，自裔位點3個（表5）。糙葉五加、二歧五加、無梗五加和 E.japonicus 在154～155位有一個AT的缺失，在330～338位分別有一個CATAAGAAA的插入片段。短柄五加、蜀五加、糙葉五加3個種種內遺傳距離均為0;甘肅產藤五加與陜西產藤五加的種內遺傳距離為0.003。屬內種間遺傳距離為0.000～0.026，平均為0.013。短柄五加與蜀五加、紅毛五加和甘肅產藤五加間的遺傳距離為0;糙葉五加與 E.japonicus 間的遺傳距離為0;二歧五加與無梗五加、刺五加之間的遺傳距離為0。可見，psbA-trnH序列在同物種之間高度保守，同屬不同種間遺傳距離差異有時不明顯，因此psbA-trnH序列也只能作為鑒別五加屬物種的依據之一。

將ITS2和psbA-trnH序列的特征參數匯總（表6）。K2P遺傳距離計算顯示，psbA-trnH序列種間遺傳距離為0.013，小于ITS2序列的種間遺傳距離（0.020）;psbA-trnH序列的變異率為3.50%，小于ITS2序列的9.09%，說明psbA-trnH較ITS2序列保守，2種候選序列種內遺傳距離為0或0～0003，小于種間遺傳距離，存在明顯的barcoding gap。

2.6 序列比對鑒定

對測定所獲得的ITS2、psbA-trnH序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中利用BLAST進行最高相似性搜索，進行確認比對分析。

2.6.1 倒卵葉五加和短柄五加的鑒定。共42個樣本，從植物形態上看完全相同，統一鑒定為短柄五加;所有樣品其測序結果ITS2序列、psbA-trnH序列完全相同。其ITS2序列與紅毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性為99.57%，而psbA-trnH序列與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為100%，因此認為短柄五加和倒卵葉五加是同一種植物，且與紅毛五加的親緣關系較近。

2.6.2 藤五加和蜀五加的鑒定。2個種共6個樣為一組，其ITS2序列完全相同，與藤五加（MH703148.1）、蜀五加（MH710849.1、MH703119.1）的相似性為100%。

在GenBank中無藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相關數據。該研究所測定的蜀五加4個樣和甘肅產藤五加1個樣共5個樣的 psbA-trnH 與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為100%;陜西隴縣產藤五加的 psbA-trnH序列與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為99.74%。

2.6.3 糙葉五加的鑒定。2個樣本為一組，其ITS2序列與紅毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性為100%，與刺五加（KU724205.1）和無梗五加（MF095901.1）的相似性為99.57%;其psbA-trnH序列與刺五加（MF348735.1）、無梗五加（KT153019.1）的相似性為99.75%，與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性僅為96.01%。

在GenBank中未見糙葉五加 ITS2和psbA-trnH序列的相關數據。

2.7 序列聚類分析

基于 K2P雙參數模型構建的系統進化樹能顯示物種間的親緣關系，幫助判斷物種的進化關系。五加屬可能起源于鵝掌柴屬（ Schefflera ）[3]，故選其作為外類群構建了系統進化樹。

2.7.1 ITS2序列的聚類分析。五加屬植物的ITS2序列經過全局比對構建的NJ系統進化樹見圖2。五加屬植物聚為一大支，其中所有測定的短柄五加、糙葉五加和紅毛五加聚為一小支，藤五加和蜀五加聚為另一小分枝。

2.7.2 psbA-trnH序列的聚類分析。psbA-trnH序列構建的五加屬植物NJ系統進化樹見圖3。五加屬植物獨聚為一支，其中所有測定的短柄五加、藤五加和蜀五加與紅毛五加等聚為一小枝，糙葉五加與無梗五加、刺五加等聚為另一小枝。

3 結論

目前 DNA 條形碼研究主要集中在如何提高近緣類群物種分辨率和構建區域條形碼數據庫2個方向。受物種特異性影響，同屬物種較低的種間差異性以及分化產生的新物種的出現，都會增加物種分類鑒定的難度。

建立良好的DNA條形碼鑒定體系需要幾個序列進行相互補充，或與其他分子標記結合，才能提高DNA條形碼技術鑒定的效率。

盡管 ITS2 序列對大多數植物可以進行鑒定，但由于其序列較短，遺傳信息有限，在鑒定近緣種或變種上仍存在一些不能鑒定的情況，增加psbA-trnH序列作為物種鑒別的輔助序列，可以將短柄五加、糙葉五加、藤五加和蜀五加準確鑒定，為鑒定短柄五加及其同屬植物提供新的分子鑒定方法，為控制藥材質量提供科學依據。

通過對現地42個短柄五加和倒卵葉五加居群的觀測，認為總葉柄的長短、傘形花序的大小、總花梗的長短是與標本采集枝條的著生部位有關，是植物適應環境條件的結果，不能作為劃分種的依據。通過對42 份植物樣本的ITS2和 psbA-trnH 序列測定分析，其種內序列差異為0，與五加屬其他物種間序列差異明顯，可以認定兩者為同一個物種，命名為短柄五加，即倒卵葉五加藥材的基原植物為短柄五加。

通過對糙葉五加、藤五加和蜀五加共8份植物樣品的ITS2和psbA-trnH序列分析，其結果與植物形態分類相吻合，也得到較好的分類結果。

在Genbank中未見糙葉五加ITS2和psbA-trnH序列，藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相關數據。

應用 ITS2 序列和 psbA-trnH 序列的聚類分析所建的NJ系統發育樹存在一定差異，在親緣關系的分析上不夠精準，還需有較多的數據積累才行。

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