五汁飲對對乙酰氨基酚誘導小鼠肝損傷的保護作用

高金星，余惠凡，覃彬華，張昌文,

（1.湖北中醫藥高等專科學校，湖北荊州 434020；2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，湖北十堰 442000）

對乙酰氨基酚（N-acetyl-para-aminophenol，APAP）是一般用于治療普通感冒的一類非甾體解熱鎮痛藥，屬于乙酰水楊酸類，由于其解熱作用較好副作用小被廣泛用于臨床，故常發生不規范性使用的現象。短期低劑量使用不會對肝臟造成影響，而對乙酰氨基酚大劑量攝入會使肝臟積累代謝有毒物質，進而引發藥物性肝損傷和肝炎[1?2]。藥物性肝損傷是指藥物本身毒性或其活性代謝產物毒性所導致的肝臟損傷，嚴重時可發展為肝功能衰竭甚至導致患者死亡[3]。對乙酰氨基酚超劑量導致葡萄糖醛酸化和硫酸化不充足以及肝臟中過量的N-乙酰苯醌亞胺消耗谷胱甘肽，一旦肝臟谷胱甘肽儲備耗盡，未結合的乙酰苯醌亞胺可與其他細胞蛋白自由組合，從而加劇肝細胞氧化應激和細胞凋亡[4?5]。

五汁飲出自清朝吳瑭《溫病條辨》一書，處方由鮮藕汁、鮮梨汁、鮮荸薺汁、蘆根水煎液、鮮麥冬汁組成，具有清熱養陰、生津止渴的功效[6]。組成是由常見食品與使用安全的中藥組成，具有很好的養身保健作用。現代藥理研究表明：梨作為常見水果，有清心、潤肺、養肝、解瘡毒和酒毒的功效[7]；荸薺富含硒、黃酮、多酚等抗氧化物質，具有抗氧化、抗癌的作用[8]；蘆根中的多糖成分具有抗氧化[9]、抗自由基作用，并可通過抗氧化作用保護肝細胞、抑制膠原沉積等途徑來抑制肝纖維化，改善肝功能，降低肝脂肪化[10]；麥冬是我國臨床常用的中藥之一，具有養陰生津、潤肺清心的功效。麥冬的主要成分有皂苷、黃酮、多糖等[11]，具有抗炎、抗氧化、增強免疫、改善肝損傷等藥理作用[12]；蓮藕是常見的蔬菜，蓮藕中的多糖、多酚物質具有降血糖作用[13]，可提升體內超氧化物歧化酶（SOD）的活性，減少丙二醛（MDA）的生成。五汁飲的所有組成成分具有良好的保肝、抗氧化、抗自由基作用，由常見食品和使用安全的中藥組成，具有很好的使用安全性。

本文采用高劑量對乙酰氨基酚誘導小鼠急性肝臟損傷模型[14]，但目前對五汁飲的營養和保健作用的機制研究較少，本文探討了五汁飲（WZY）對對乙酰氨基酚AP所致小鼠急性肝損傷的保護作用及可能機制，為五汁飲的研究與開發新型保健飲品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性KM小鼠 40只，5～6周齡，體重18～22 g，由動物實驗中心提供，合格證號SCXK（鄂）2019-0017，小鼠每天給予充足的水和飼料，3 d后開始實驗；新鮮的梨、荸薺、藕 1000 g，均購買于本地市場；蘆根和麥冬1000 g，本地藥房；HE染液、谷草轉氨酶（AST）試劑盒、谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；對乙酰氨基酚 純度99%，上海源葉生物有限公司。

RE-5203旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ш型循環水真空泵 上海知信實驗儀器有限公司；AR224CN分析天平 奧豪斯上海有限公司。Leica DMI6000B熒光顯微鏡 德國徠卡顯微系統（上海）有限公司；GL-12C高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 五汁飲樣品制備 梨（去心皮）、荸薺、藕洗凈榨汁合并，蘆根和麥冬（各500 g）放入大砂鍋內，加入2 L水，浸泡30 min后置大火上煮沸30 min后，改小火煮30 min，過濾，合并梨、荸薺、藕汁，小火煎煮10 min，反復三次，紗布擠壓過濾，濾液減壓濃縮為2.0 g生藥/mL濃縮液，密封，放入4℃冷藏。

1.2.2 動物分組及造模給藥處理 參考文獻[15]，40只昆明小鼠適應性飼養1周后隨機分為5組：空白組、模型組、五汁飲低劑量組（100 mg/kg）、五汁飲中劑量組（200 mg/kg）和五汁飲高劑量組（400 mg/kg），每組8只。五汁飲（低、中、高）組小鼠持續灌胃給藥7 d，每日1次，空白組和模型組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。最后一次給藥2 h后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射AP（300 mg/kg）建立肝損傷模型。24 h后，對小鼠進行眼球取血，靜置離心后留取上清檢測相關指標；取小鼠肝臟和脾臟稱重記錄，后取一部分肝組織固定于福爾馬林溶液中，用于肝組織切片染色觀察病理變化，另一部分肝組織凍存，用于后續相關指標檢測。

1.2.3 免疫器官指數檢測 稱小鼠體質量及肝臟和脾臟質量，計算臟器指數。肝臟（脾臟）指數＝肝臟（脾臟）質量/體質量。

1.2.4 血清指標檢測 小鼠進行眼球取血，靜置離心（2000 r/min，4℃，離心5 min）后留取上清液用試劑盒檢測ALT、AST酶活力。

1.2.5 氧化應激指標檢測 取?80℃凍存的小鼠肝組織，置于冰上解凍后，加入生理鹽水，勻漿，離心（5000 r/min，常溫，離心5 min），留取上清液，按照GSH和MDA試劑盒的操作說明書測定相關指標。

1.2.6 炎癥因子的檢測 取血清，按照試劑盒說明書，測定TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.2.7 HE染色 按照HE染色步驟進行染色，封片，在顯微鏡下觀察拍照。將H&E染色后的肝組織切片置于顯微鏡下觀察，根據AP肝損傷評價標準對其進行評分統計。肝損傷評價標準為：0級（0～1分）：無明確肝損傷的形態學特征；1級（1～2分）：肝小葉Ⅲ區，靜脈周圍散在的片狀壞死病灶；2級（2～3分）：靜脈周圍散在的片狀壞死病灶，一直延續到Ⅱ區；3級（3～4分）：靜脈片狀壞死病灶，一直延續到Ⅰ區。

1.2.8 Tunel染色 將待染色的片子置于脫水框中，脫蠟水化步驟同HE染色，接著用3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，再滴加0.01 mol/L TBS新鮮稀釋的Proteinase K（1:200），37℃條件下消化12 min，接著在37℃條件下，依次用標記緩沖液孵育2 h、封閉液孵育30 min、抗體稀釋液稀釋的生物素化抗地高辛抗體（1:100）孵育30 min，抗體稀釋液稀釋的SABC（1:100）孵育30 min，最后置于新鮮配制的DAB發色液中，至鏡檢出現陽性信號出現，再置于蘇木素中，之后同HE染色脫水、樹脂封片步驟，待片子風干，置于顯微鏡下觀察肝組織細胞炎癥與凋亡情況。

1.3 數據處理

所有數據采用GraphPad Prism 5.01科學統計繪圖軟件進行分析，以Mean±SD表示，組間和組內采用雙向方差分析，當P<0.05時，表示數據之間具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 五汁飲對小鼠臟器指數的影響

給藥7 d后，五汁飲對小鼠臟器指數[16]的影響結果見表1。觀察可見模型組小鼠肝組織出現腫大，說明造模成功，肝臟指數的降低說明給藥組對于肝臟腫大有緩解作用。與空白組相比，模型組小鼠的肝臟指數下降高度顯著（P<0.001）；與模型組比，除低劑量組外，五汁飲可顯著（P<0.05或P<0.01）降低小鼠的肝臟指數，其中以高劑量組的五汁飲降低效果最為顯著（P<0.01）。結果表明，適宜劑量的五汁飲能夠改善APAP致急性肝損傷小鼠的肝腫脹情況。

表1 五汁飲對AP致急性肝損傷小鼠臟器指數的影響（±s,n=8）Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)

表1 五汁飲對AP致急性肝損傷小鼠臟器指數的影響（±s,n=8）Table 1 Effects of WZY on organ indices in acute liver-injury mice induced by AP( ±s,n=8)

注：與空白組相比，*表示數據差異顯著，P<0.05；**表示數據差異極顯著，P <0.01；***表示數據差異高度顯著，P<0.001；與模型組相比，#表示數據差異顯著，P<0.05；##表示數據差異極顯著，P<0.01；###表示數據差異高度顯著，P<0.001；表2、圖1～圖3同。

2.2 五汁飲對小鼠血清指標的影響

ALT和AST是肝損傷的主要指標參數，當肝臟受到損傷時，這些生理指標會在血液中發生變化，二者在血清中的指數會有所升高[17?18]。如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中ALT（P<0.001）和AST（P<0.01）活力均顯著升高；給予五汁飲后，與模型組相比，小鼠血清中ALT和AST活力均有不同程度的減少，其中，高劑量的五汁飲給藥組引起小鼠機體變化，其顯著降低了AP作用于小鼠機體血清中ALT（P<0.001）和AST（P<0.05）的水平。結果表明五汁飲對對乙酰氨基酚所致的急性肝損傷有一定的保護作用。

圖1 五汁飲對AP致急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平的影響（±s,n=8）Fig.1 Effects of WZY on serum ALTand AST levelsof acute liver-injury miceinduced by AP( ±s,n=8)

2.3 五汁飲對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中GSH（還原型谷胱甘肽）含量顯著降低（P<0.001），而五汁飲的中（P<0.01）、高劑量組（P<0.001）不同程度地改善了AP引起的小鼠肝組織中GSH含量的減少。MDA水平顯示組織的脂質過氧化物的多少，含量與細胞的受損程度有關[19?20]。與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P<0.001）；與模型組比，中、高劑量的五汁飲顯著降低了小鼠肝組織中MDA的含量（P<0.05）。結果表明五汁飲能夠提高肝組織抗氧化能力并緩解AP對肝細胞產生的脂質過氧化作用。

圖2 五汁飲對AP致急性肝損傷小鼠肝組織中GSH和MDA含量的影響（±s,n=8）Fig.2 Effectsof WZY on liver GSHand MDA levelsof acute liver-injury miceinduced by AP(±s,n=8)

2.4 五汁飲對小鼠肝組織中炎癥因子的影響

肝組織中炎癥因子水平反映炎癥反應的強弱[21?23]。由表2可知，與空白組相比，模型組的炎癥因子含量明顯升高；與模型組相比，五汁飲低、中、高劑量組顯著抑制了組織中炎癥因子的升高（P<0.05或P<0.01）。

表2 五汁飲對小鼠肝臟中炎癥因子的影響Table 2 Effectsof WZY on inflammatory factors in liver of mice

2.5 五汁飲對小鼠肝組織病理變化的影響

如圖3所示，空白組小鼠的肝組織細胞排列整齊，肝小葉結構清晰；HE染色結果顯示，模型組小鼠肝組織中央靜脈周圍多數融合壞死，且部分壞死面積從III區擴張至II區，并伴混合性炎細胞浸潤，Tunel凋亡染色圖片可看出模型組小鼠肝臟中央靜脈周圍細胞變性腫脹，大部分肝細胞凋亡，呈現灶狀壞死[24?25]；經過五汁飲的干預，小鼠肝組織細胞的凋亡壞死情況得到不同程度的改善，五汁飲高劑量組細胞完整，排列整齊，肝組織炎癥浸潤現象輕微，顯著減輕了AP引起的小鼠肝細胞凋亡壞死癥狀，并改善了肝組織的炎癥浸潤程度，從而改善肝組織的損傷情況。

圖3 五汁飲對AP致小鼠肝組織細胞損傷的影響Fig.3 Effects of WZY on liver tissue pathological changesy of acuteliver-injury miceinduced by AP

3 結論

本實驗中通過對小鼠腹腔注射高劑量對乙酰氨基酚溶液，導致小鼠出現肝臟損傷現象，探討五汁飲對對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護作用。結果表明，五汁飲高、中劑量組小鼠血清中ALT和AST的水平均有明顯下降，GSH活性提高，MDA水平降低，肝組織切片顯示肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善。說明五汁飲具有清除自由基、抑制脂質過氧化反應、防止細胞膜受損、減輕細胞腫脹壞死的效果，對藥物所致肝損傷具有顯著保護作用。五汁飲對對乙酰氨基酚所致肝損傷具有一定的保護作用，其保護機制與提高抗氧化酶體系活力、抑制脂質過氧化、維持肝細胞膜正常形態有關。綜上所述，五汁飲能保護AP所致的小鼠急性肝損傷，其機制與抑制氧化應激、緩解炎癥反應有關，這為五汁飲的研究與開發提供了理論依據。