全自動固相萃取-UPLC-MS/MS法檢測清咽類保健食品中非法添加的鹽酸二氧丙嗪和沙丁胺醇

王 任，吳鴛鴦，胡 磊，張麗媛，程巧鴛

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052）

近年來，隨著人們自我健康意識的提高以及我國大健康產業迅猛發展，消費者對保健食品的需求進一步增加。一些不法商家為吸引消費者，謀取高額利潤，在保健食品中非法添加短期內見效快、副作用大的化學藥物[1?5]，這種情況多見于清咽類保健食品[6?9]。鹽酸二氧丙嗪作為一種抗組胺藥，具有鎮咳、祛痰、平喘和粘膜表面局麻等作用[7]。沙丁胺醇是選擇性β2受體激動劑，可通過松弛氣道平滑肌擴張支氣管，緩解支氣管痙攣[10]。在某些清咽類的保健食品中添加了這兩類化學成分[11]，以達到快速緩解咽喉不適的效果，但長期食用此保健食品會導致機體依賴并加重病癥[12?13]，因此需要積極開展對化學藥物非法添加檢測方法的研究。

由于保健食品基質成分復雜，采用固相萃取凈化處理可以達到富集目標物質和凈化效果。傳統的固相萃取技術是人工操作，會有平行性不好，操作過程時間長等缺點。近年來，在人工固相萃取的基礎上改進的全自動固相萃取實現了活化、上樣、淋洗、干燥、洗脫全過程依照程序設置自動完成，相對傳統的固相萃取裝置有節約時間、溶劑和人力成本等優勢。全自動化的樣品前處理過程不僅可解決傳統固相萃取操作耗時的缺點，還可減少人為誤差[14?17]。已有文獻報道傳統的固相萃取方法處理保健食品[17?20]，但利用全自動固相萃取技術處理樣品的研究卻鮮有報道。同時在UPLC-MS/MS檢測過程中，基質效應也是不可忽略[21]，尤其是針對基質復雜的保健食品，需對樣品提取液進行有效的凈化才能得到準確的定量結果。通過混合型陽離子交換固相萃取柱（MCX），可以降低UPLC-MS /MS測定過程中的基質效應。

目前，保健食品中非法添加化學物質的檢測方法有TLC[22?23]、HPLC[24?26]、HPLC-MS /MS[7,27]、UPLCQTOF MS[28?29]法等方法。薄層色譜法易受干擾導致定性定量不準確，而且容易出現假陽性；高效液相色譜檢測結構類似物質時會有干擾，同時檢出下限較高[30?31]。而UPLC-MS/MS聯用技術能將高效液相色譜對復雜樣品的高分離能力與三重四極桿質譜的高靈敏性和高選擇性有效結合起來，因此色譜-質譜聯用技術具有靈敏度高、穩定性好、定性定量更準確等特點而被廣泛用于檢測工作。

本研究以清咽類保健食品為研究對象，通過全自動固相萃取技術凈化樣品，采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定清咽類保健食品中非法添加的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪，該方法前處理簡單、重復性、準確性好，適合大批量樣品中非法添加的化學物質的快速測定，以期為保健食品中非法化學物質添加監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

保健食品樣品 基質包括含片（立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片，都樂牌金嗓子喉片）、糖果（京都念慈菴琵琶糖，潘高壽胖大海潤喉糖）以及液體（京都念慈菴蜜煉川貝枇杷膏，同仁堂枇杷秋梨膏）3種劑型，國家、省級抽檢及市售；甲酸銨、甲酸、甲醇、乙腈 均為色譜純，Sigma 公司；氨水、乙酸銨 均為分析純，國藥集團；水 超純水；沙丁胺醇對照品（含量99.7%，批號100204-201103）、鹽酸二氧丙嗪對照品（含量99.9%，使用前105℃干燥2 h，批號100299-201202）中國食品藥品檢定研究院；CQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC-C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）、Oasis HLB固相萃取柱（3cc/60 mg）、Oasis MCX固相萃取柱（3cc/60 mg）Waters；ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8μm） Agilent ；C18固相萃取柱（200 mg） Agela。

1290-G6460QQQ三重四極桿質譜儀 美國安捷倫；Fotector Plus型高通量全自動固相萃取儀 睿科公司；Genpure Pro UV/UF超純水系統 美國熱電公司；MS205DU 電子天平 瑞士梅特勒-托麗多儀器公司；P300H超聲波清洗器 德國艾爾瑪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 精確稱取沙丁胺醇對照品42.84 mg至100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，超聲10 min（200 W，30 k Hz），放冷，甲醇定容，即得沙丁胺醇儲備液。準確稱取鹽酸二氧丙嗪對照品49.28 mg于100 mL棕色量瓶中，甲醇溶解，超聲10 min （200 W，30 kHz），放冷，甲醇定容，即得鹽酸二氧丙嗪標準儲備液。分別精確移取沙丁胺醇標準儲備液和鹽酸二氧丙嗪標準儲備液各1.0 mL于100 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，即得混合標準儲備液，置于4℃保存。

1.2.2 供試品溶液制備

1.2.2.1 提取 取一次口服劑量供試品（片劑：立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片）（糖果和液體劑型也取相當于一次口服劑量），研細，精確稱取0.5 g（精確到0.0001 g），置于50 mL棕色容量瓶中，加 p H5.2的0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液25 mL，超聲10 min （200 W，30 kHz），加約20 mL 甲醇溶解，超聲10 min （200 W，30 kHz），放冷，甲醇定容[32]。

1.2.2.2 凈化 將提取液全部轉移至全自動固相萃取儀中進行凈化富集，采用MCX固相萃取柱，凈化富集程序見表1。收集洗脫液于10 mL試管中，40℃下吹氮至近干，用10%甲醇水溶液（內含0.1%甲酸）溶解殘渣，轉移定容至50.0 mL容量瓶，得到待測液，待測液經過0.22μm有機濾膜過濾后待上機測定。

表1 全自動固相萃取儀的凈化富集程序Table 1 Program of purification and enrichment by the automatic solid phase extraction installation

1.2.3 陰性空白樣品溶液制備 取供試品的陰性空白基質（立鐵鉆牌鐵皮楓斗含片：未檢出待測化合物），按“1.2.2”項下條件制備陰性空白樣品溶液。

1.2.4 UPLC-MS/MS的色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱；柱溫：25℃；流速：0.2 mL/min；進樣體積：1.0μL；梯度洗脫：流動相A為含有10 mmol/L甲酸銨的0.1%（v/v）甲酸溶液，流動相B為甲醇，流動梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度表Table 2 Flow phasegradient table

1.2.5 UPLC-MS/MS的質譜條件 掃描方式：電噴霧離子源（ESI+），正離子模式掃描模式；檢測模式：多反應監測（MRM）掃描；毛細管電壓：3000 V；離子源溫度：300℃；脫鞘氣流速：11 L/min，霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮氣。優化后相關質譜參數見表3。

表3 質譜MRM參數Table 3 Mass spectrometry parameters

1.3 數據處理

采用QQQ quantitative analysis.B0700和Excel 2003軟件進行平均值、回收率及相對標準偏差計算，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇及優化

沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪均易溶于極性溶劑。本試驗探索了不同提取液對待測物提取效率的影響，樣品經不同溶劑提取后，經固相萃取柱凈化，復溶上樣分析。本試驗選取100%甲醇、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（2:5，v/v）、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:5，v/v）、乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:2，v/v）進行了比較，結果見圖1。待測加標樣品過MCX固相萃取柱凈化后，測定結果發現100%甲醇提取液提取的待測溶液中沙丁胺醇回收率為0，鹽酸二氧丙嗪回收率為98.2%～98.6%，RSD為2.1%～3.0%。乙酸銨緩沖溶液:甲醇（2:5，v/v）提取液提取的待測溶液中沙丁胺醇回收率為88.5%～90.1%，RSD為3.5%～3.9%，鹽酸二氧丙嗪回收率達到95%以上，隨著乙酸銨緩沖溶液在提取溶液中的比例增加，沙丁胺醇回收率提高并趨于穩定，維持在95%（RSD<5%）以上，而鹽酸二氧丙嗪回收率未有太大改變。這是因為沙丁胺醇在乙酸銨緩沖溶液的提取液里帶有正電荷，過MCX固相萃取柱后可以與其通過靜電作用結合，而在100%甲醇提取液里無法與MCX固相萃取柱結合從而被洗脫下來[33]。同時基于環保與成本考慮，本試驗選用乙酸銨緩沖溶液:甲醇（5:5，v/v）作為提取溶液。

圖1 不同提取溶劑及溶劑比例對待測物回收率的影響（n=3）Fig.1 Effect of different extraction solvents and solvent ratio on recoveries(n=3)

2.2 固相萃取柱優化

由于保健品基質較為復雜，其中的糖類、色素等雜質會干擾目標物的檢測，在進行前處理時，需要消除這些雜質對目標物的干擾，因此需對提取后的溶液進行凈化處理。本試驗考察了C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱及MCX固相萃取柱對沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪測定結果的影響，結果見圖2。結果發現，C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱對沙丁胺醇并無保留，鹽酸二氧丙嗪的回收率較好，均達90%以上，RSD<5%。而MCX固相萃取柱的使用方法是先用酸化的試劑進行清洗后再用堿化試劑洗脫，溶液中的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪經MCX固相萃取柱凈化后均獲得了較高的回收率，且重復性較好，其中待測兩種物質的加標回收率均達90%以上，RSD<5%。因為MCX固相萃取柱有效整合了C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱的優點，組分中既包含與C18固相萃取柱和HLB固相萃取柱類似的疏水基團，可以通過疏水作用去除提取液中的糖、色素等雜質，又包含強陽離子基團（磺酸基），可通過靜電作用力吸附待測的沙丁胺醇，通過淋洗液和洗脫液的合理選擇實現保健食品中待測物質的有效凈化。因此，試驗選用MCX型固相萃取柱對樣品進行凈化富集。

圖2 不同固相萃取柱對待測物回收率的影響（n=3）Fig.2 Effectsof different SPE columnson the recoveries of subjects (n=3)

2.3 洗脫溶劑優化

洗脫溶劑的選擇是影響待測物質回收率的一個重要因素。本試驗選取不同比例的氨水與甲醇洗脫液對回收率的影響進行考察。氨水與甲醇比例分別設置為0.5:100（v/v），1:100（v/v），3:100（v/v），5:100（v/v），10:100（v/v）和100%甲醇。由圖3可知，100%甲醇洗脫的加標待測樣品中沙丁胺醇回收率為0，鹽酸二氧丙嗪回收率為90%（RSD<5%）以上，而0.5%氨水甲醇洗脫的加標待測樣品回收率為82.9%～83.6%，RSD為3.1%～4.0%，隨著氨水的比例提高，待測樣品加標回收率也相應提高，當氨水比例達到3%時，兩種待測物質回收率均在90%（RSD<5%）以上。因為沙丁胺醇分子結構含有氨基結構，堿性洗脫劑通過改變離子強度和破壞分子間力，使目標化合物被洗脫下來，得到了較高的回收率。綜合考慮，實驗最終選擇3%氨水甲醇為洗脫溶液，可在不影響待測化合物回收率的前提下，較好地的去除提取液中的極性雜質，凈化基質。

圖3 不同比例的氨水和甲醇洗滌液對回收率的影響（n=3）Fig.3 Effectsof different proportionsof ammonia water and methanol on the recovery (n=3)

2.4 色譜柱的選擇

本實驗考察了ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8μm）以及ACQUITY UPLC BEH HILIC-C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）3種色譜柱的分離效果，結果見圖4。在同等色譜條件下，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪在3種色譜柱上都可以得到較好的分離。但是沙丁胺醇在ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）柱上峰形對稱，相應較高，且保留時間最短。這是因為ACQUITY UPLC BEH C18是端基封尾的色譜柱，且固定相無殘留的硅羥基，可以改善峰形，同時耐受p H更廣。因此選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱進行分離。

圖4 色譜柱分離效果對比Fig.4 Comparison of chromatographic column separation effect

2.5 流動相的選擇

流動相是影響色譜峰形狀和分離度的一個重要條件。本實驗對同一濃度的混合標準曲線溶液，分別考察了甲醇-0.1%甲酸，甲醇-10 mmol/L甲酸銨和甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）系統。在流動相中加入揮發性有機酸即可以提高離子化效率，同時也有利于樣品的溶解，故在流動相中添加甲酸。結果顯示，盡管3個系統都可以得到較好的峰形和分離度，但是正離子模式下，在水溶液中添加一定濃度的甲酸能夠有效地提高分析物離子化的效率[16]，試驗以甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）對待測物進行梯度洗脫，獲得的峰靈敏度更高。在保證實驗靈敏度的前提下，最終采用甲醇?0.1%甲酸溶液（10 mmol/L甲酸銨）系統。

2.6 子離子選擇及碰撞能優化

根據目標物的性質，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪較易得到一個質子得到母離子，所以2種化合物均采用正離子模式，分別得到一個質子形成母離子[M+H]＋。在正離子模式下，分別進行一級質譜掃描（Q1掃描）、二級質譜掃描（子離子掃描）和多反應監測（MRM）掃描。在Q1掃描中找出每個化合物的母離子，在子離子掃描中找到響應較大的子離子，最后在MRM 掃描下優化碰撞能參數，選擇響應較高、穩定性好的1個子離子作為定量離子，1個子離子作為定性離子。結果見圖5～圖7。

圖5 混合對照品溶液PI圖Fig.5 Mixed control solution picture of PI

圖7 混合標準曲線溶液和供試品（含片Ⅰ）的MRM質譜圖Fig.7 Mixed standard curve solution and sample (LozengeⅠ)solution pictures of MRM

2.7 基質效應影響

圖6 混合對照品對應二級MS質譜圖Fig.6 Mixed control solution PI pictures of secondary mass spectrum

采用質譜進行定量分析時需要考慮基質效應的影響。保健食品基質較為復雜，經簡單處理后依然有多種非待測物質保留在樣品溶液里[34]，進入電離源時會對目標物的離子化過程產生干擾，對檢測方法的靈敏度和準確度造成一定影響，進而影響試驗的檢測結果。本試驗采用基質加標標準曲線定量法：添加40 mg/L混合標準溶液制成基質加標液，與流動相加標溶液進行比較，空白基質中標準物質的峰面積（A）和甲醇中標準物質的峰面積（B）的比值考察基質效應（ME），ME=A/B×100%，當ME<1時，說明存在基質抑制作用；當ME>1時，說明存在基質增強作用[16]。實驗結果表明，鹽酸二氧丙嗪在保健品基質中的ME為0.94～0.98，而鹽酸二氧丙嗪在保健品基質中的ME為0.78～0.83，鹽酸二氧丙嗪存在一定的抑制效果，為消除基質效應的影響，因此本實驗采用空白基質加標標準曲線定量法。

2.8 標準曲線和檢測下限

本實驗采用陰性空白基質配制混合標準曲線溶液。以各定量離子色譜峰的峰面積為縱坐標，對照品的濃度為橫坐標，制作標準曲線。以3倍信噪比（S/N）計算得到檢出限（LOD）；以10倍信噪比（S/N）計算得到定量限（LOQ）。各回歸方程和相關系數見表4。結果顯示這2種化學物質在相應的濃度范圍內呈良好的線性關系，決定系數R2均大于0.999，表明本方法可以對含有這2個化學成分的樣品進行定量分析。

表4 2個化學成分的線性回歸方程及檢出限和定量限Table 4 Linear regression equations,LOD and LOQof two components

2.9 精密度和重復性實驗

取同一濃度混合標準曲線溶液驗證精密度，按照“1.2.4”和“1.2.5”項下的液相和質譜的條件進行分析，進行6次平行測試，分別計算2個化學成分峰面積的相對標準偏差，沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的峰面積RSD均在1.3%～2.7%之間，均<5%，說明該實驗方法具有良好的儀器精密度，符合分析測定的要求。選取同一加標樣品共6份，按照“1.2.2”項下條件進行前處理得到供試品溶液，按照“1.2.4”和“1.2.5”項下的液相和質譜的條件進行分析，同一批進樣，結果表明檢出的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪含量的重復性RSD均在1.1%～1.9%之間，均<5%，表明該方法的重現性良好。

2.10 穩定性實驗

取同一濃度混合標準曲線溶液測定穩定性，分別于1.0、4.0、10.0、15.0、20.0、24.0 h注入超高效液相色譜-串聯質譜儀進行測定，以沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的各自定量離子峰面積為指標，測定其RSD。結果表明沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的穩定性RSD分別為3.1%和4.1%。表明沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪在24 h內基本穩定。

2.11 加標回收實驗

精密稱取陰性空白樣品（片劑、糖果和液體劑型）各9份，按照1倍檢出限（2μg/kg）、3倍檢出限（5μg/kg）和5倍檢出限（10μg/kg）加入適量濃度的混合標準曲線溶液，按照“1.2.2”項下條件制備供試品溶液，按“1.2.4”和“1.2.5”項下的液相和質譜的條件進行分析，測定峰面積，如表5所示，結果得片劑中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為90.8%～95.2%和92.8%～98.7%，RSD分別為1.2%～2.0%和0.83%～3.1%；糖果劑型中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為87.4%～94.8%和90.1%～98.8%，RSD分別為1.6%～3.9%和2.0%～3.7%；液體劑型中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的回收率范圍分別為89.9%～95.2%和92.8%～98.6%，RSD分別為1.6%～2.4%和1.2%～1.8%。結果表明，該方法的準確度滿足試驗需求。

表5 供試品的加標回收率和偏差（n=3）Table 5 Recoveries and RSD(n=3)

2.12 實際樣品測定

此次實驗選取以含片、糖果以及液體劑型為主的國家抽檢和省級抽檢保健食品6批次。按照“1.2.2”項下條件備供試品溶液，按“1.2.4和1.2.5中的液相和質譜的條件進行分析檢測沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪。含片、糖果以及液體樣品均未檢出沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪。

3 結論

本實驗采用UPLC-MS/MS法，結合全自動固相萃取儀，建立清咽類保健食品中沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪的同時快速測定方法，外標法定量，并對相關條件進行優化。相比于傳統人工過固相萃取柱的方法，本試驗建立了基于混合型陽離子固相萃取柱的全自動固相萃取的前處理方法，實現自動化，減少人力本，減少人工誤差，實現了固相萃取流速的可控性，提高了試驗的重復性和準確性，縮短了樣品處理周期，適用于大批量樣品的前處理。該方法同時對色譜和質譜條件進行了優化，對清咽類保健品中非法添加的沙丁胺醇和鹽酸二氧丙嗪進行定性和定量分析。故本文方法的建立能為檢測清咽類保健食品中非法添加化學成分檢測提供了理論基礎，對提高保健食品安全事件的應急處理能力具有重要的參考意義。