長鏈非編碼RNA組蛋白去乙酰化酶3通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路調控肝癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡

陳斌，王猛，張囡囡

作者單位：1棗莊礦業集團中心醫院肝病科，山東 棗莊277000；2棗莊市市中區人民醫院感染性疾病科，山東 棗莊277000

肝癌是世界上常見的一種惡性腫瘤，其發病率居所有癌癥第五位，致死率居所有癌癥第二位。由于肝癌的發病隱匿，一旦確診已至晚期，并且極易發生轉移，以致其致死率極高。因此，研發有效的治療藥物對肝癌病人具有重要意義。組蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）具有抑制組蛋白發生乙酰化和基因轉錄的作用，其在腫瘤中過度表達導致抑癌基因表達下調，以促進腫瘤的發展。組蛋白去乙酰化酶3在很多腫瘤中均表現出表達異常升高，其中包括肝癌，令人遺憾的是其在肝癌細胞的細胞表型變化中的作用尚未十分清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守且廣泛表達于哺乳動物中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，歸屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶（phosphatidylinositol 3-kinase related kinase，PIKK）家族。mTOR信號通路抑制劑在癌癥的臨床治療中已得到普遍應用，但是該通路是否參與HDAC3在肝癌中的功能機制尚未完全清楚。本研究于2018年9月至2019年5月擬以肝癌細胞SK-Hep1為研究對象，檢測其中HDAC3的表達，觀察敲減HDAC3、激活mTOR信號通路對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，以期揭示其機制可能與敲減HDAC3抑制mTOR信號通路活性相關，為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細胞細胞系CVCL_SA11 MIHA、肝細胞癌細胞細胞系CVCL_0525 SK-Hep1均購自美國菌種保藏中心（ATCC）；DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青；CCK-8試劑盒購自美國sellect公司；Lipofectamine2000、RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；mTOR信號通路抑制劑MHY1485購自美國AbMole公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自德國羅氏公司；ECL發光液購自北京雷根生物公司；RIPA蛋白裂解液均購自碧云天公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養將SK-Hep1細胞和MIHA細胞用DMEM培養基（含10%胎牛血清）在5%二氧化碳，37℃細胞培養箱中正常培養，每2～3天傳代1次。

1.2.2

細胞轉染與分組把正常培養的對數期肝細胞癌細胞SK-Hep1和肝正常細胞MIHA標記為SK-Hep1組、MIHA組；使用脂質體試劑盒Lipofectamine2000將si-NC、si-HDAC3（購自上海吉瑪公司）、si-HDAC3+DMSO、si-HDAC3+MHY1485轉染至SK-Hep1細胞，48 h后，實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測轉染效率（按照“1.2.3”的方法操作，檢測各組細胞中HDAC3的表達水平，以檢測轉染是否成功）。

1.2.3

qRT-PCR法檢測細胞 中HDAC3的mRNA表達收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細胞，提取RNA，逆轉錄為互補DNA（cDNA）。qRT-PCR檢測試劑盒檢測各個樣本中HDAC3 mRNA的含量。計算方法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，2法計算HDAC3的相對表達。引物信息（5'-3'）：HDAC3，正向引物GCTGCTGGACATATGAGAC，反向引物TGCCTCTGGCCTGCTATA；GAPDH，正 向 引 物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.2.4

CCK-8法檢測細胞增殖取對數生長期的

si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細胞，將其調整為10個/毫升，取100 μL加入到96孔板，培養24 h。然后加入20 μL的CCK-8溶液，在490 nm波長下檢測吸光度。吸光度與細胞增殖能力成正比。

1.2.5

Transwell小室檢測細胞遷移侵襲為了檢測si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細胞的遷移和侵襲能力，使用未鋪基質膠、鋪有基質膠的Transwell小室分別檢測細胞遷移、侵襲能力，二者的操作步驟相同。具體操作方法如下：將細胞先用無血清培養基培養24 h，調整細胞至10個/毫升，取200 μL均勻緩慢注入上室聚碳酸酯膜，600 μL含血清培養基加入下室，培養箱培養24 h。擦下上室聚碳酸酯膜表面細胞。甲醇固定，結晶紫染色。最后，用濕棉簽擦去膜上表面剩余的細胞，再用鑷子輕輕取下聚碳酸酯膜，使其下表面朝上，進行載玻片封片。用顯微鏡400倍觀察細胞的數量，隨機選取5個視野，拍照計數，取平均值。

1.2.6

膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）/碘化丙啶（PI）雙染檢測細胞凋亡收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細胞，用200 μL結合緩沖液懸浮。先加入5 μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，然后加入5 μL的PI，結束染色后，立即上機，檢測分析凋亡情況。細胞的凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次，實驗重復3次。

1.2.7

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測細胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1、S6K1蛋白表達收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細胞，用RIPA裂解液裂解，BAC法進行定量，100℃水浴變性，12 000 r/min離心10 min，取上清。然后將準備好的濃縮膠、分離膠小心拔出梳子，取50 μL進行上樣，電泳后，將蛋白轉至PVDF膜上。轉膜過程需要注意的是整個儀器和環境需要保持0～4℃的低溫狀態。轉膜結束后，用

2.5

%的脫脂奶粉進行封閉，洗膜。將膜浸入500～1 500倍稀釋的各個一抗反應液中孵育過夜。次日，先進性洗膜，然后將膜轉移至稀釋過的二抗反應液中4℃孵育2 h，洗膜。最后，進行顯影、定影和曝光，整個過程需在暗室中進行。用Image J分析條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

2 結果

2.1 HDAC3在肝癌細胞中的表達

與MIHA組比較，SK-Hep1組細胞中HDAC3的表達異常升高［（1.00±0.06）比（4.38±0.34），

t

=29.370，

P

＜0.001］。可見，HDAC3在肝癌細胞中高表達。

2.2 敲減HDAC3的肝癌細胞

與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細胞 中HDAC3 mRNA的 表達異常降低［（0.32±0.03）比（1.01±0.07），

t

=27.180，

P

＜0.001］。提示，成功構建敲減HDAC3的肝癌細胞。

2.3 敲減HDAC3對肝癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

結果如表1所示，與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細胞在48、72h細胞活性顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）。

表1 敲減組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）對肝癌細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響/±s

2.4 敲減HDAC3對肝癌細胞中mTOR信號通路活性的影響

結果如圖1和表2所示，與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1蛋白表達均顯著降低（

P

＜0.001），S6K1蛋白表達差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

表2 敲減組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的肝癌細胞哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路相關蛋白的表達/±s

圖1 敲減組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的肝癌細胞哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路相關蛋白的表達

2.5 激活mTOR信號通路對敲減HDAC3抑制肝癌細胞增殖、遷移侵襲和促進凋亡的影響

結果如表3所示，與si-HDAC3+DMSO組相比，si-HDAC3+MHY1485組SK-Hep1細胞中HDAC3表達顯著升高，在48、72 h細胞活性顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（

P

表3 激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路對敲減組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）抑制肝癌細胞增殖、遷移侵襲和促進凋亡的影響/±s

＜0.05）。

3 討論

HDAC3在細胞周期調節中起關鍵作用，并且其在胰腺癌、乳腺癌、淋巴瘤中均表現出失調，也包括肝細胞癌。Lu等在肝癌的研究中報道，敲除HDAC3后能夠明顯損害肝臟再生和肝細胞增增，過表達HDAC3與肝癌的生長和預后不良緊密相關，敲減HDAC3則可以抑制肝癌的生長。Wu等研究報道，HDAC2在肝癌病人的腫瘤組織中表達異常升高，并且其可通過激活Hedgehog信號通路加重肝癌病人的惡性化進程。由此可見，HDAC3在肝癌發生發展中的重要作用。我們運用檢測了肝癌細胞中HDAC3的表達發現其異常升高，這與前人的研究結果相一致。進一步研究，我們建立敲減HDAC3的肝癌細胞，并通過CCK-8、Transwell小室、流式細胞術檢測細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡發現，敲減HDAC3后，肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲均被抑制，細胞的凋亡得到促進，這揭示了HDAC3對肝癌細胞表型變化的調控作用。進一步研究發現，敲減HDAC3可抑制肝癌細胞中mTOR信號通路的活性，因此我們認為HDAC3在肝癌中的功能可能與該通路具有一定的相關性。

研究發現，mTOR信號通路在人類多種癌癥發生異常。矮甘草皂苷單體13（DT-13）在體外通過激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）并抑制m-TOR來阻斷結直腸癌腫瘤生長。mTOR/p70S6K通路在卵巢癌中被激活。卡鉑可迅速mTOR表達，使卵巢癌細胞阻滯在G0/G1期，并誘導細胞凋亡。過表達微小RNA-1（miR-1）可通過靶向下調原癌基因c-Met，調控Akt/mTOR信號通路來抑制前列腺癌細胞的存活和增殖。大量研究報道，mTOR信號通路在肝癌的發生、發展、診斷治療中均具有重要的調控作用。Malakar等報道，在肝癌中抑制mTOR的活性能夠逆轉原癌基因MALAT1對肝癌的致癌特性。我們研究發現，敲減HDAC3能夠抑制肝癌細胞中mTOR信號通路相關基因Akt、4E-BP1、p-S6K1的蛋白表達，揭示敲減HDAC3能夠抑制肝癌中mTOR信號通路的活性，此結果為探索肝癌中HDAC3發揮作用的功能機制的研究提供了依據。激活mTOR信號通路能夠部分逆轉敲減HDAC3的抑制肝癌細胞的細胞表型惡性化發展的作用。不僅敲減HDAC3能夠抑制mTOR信號通路的活性，激活mTOR信號通路也能夠逆向調控HDAC3的表達和功能。這為HDAC3在肝癌的診斷、基因治療和靶向治療中的應用提供了依據。

基于本研究結果，認為長鏈非編碼RNA HDAC3抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，其機制與可能失活mTOR信號通路相關。