亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性在產前篩查前的性能驗證

張艷秋

【關鍵詞】 亞甲基四氫葉酸還原酶基因;產前篩查;PCR+ 金標免疫層析法;性能驗證

隨著二胎政策放開，高齡孕婦與日俱增，這不僅僅要求醫師提高剖宮產的手術技能，減少孕產婦死亡率，更為檢驗科工作人員和臨床醫師敲響警鐘，如何聯合協作做好產前篩查，降低新生兒畸形和死亡率。出生缺陷影響著新生兒的生存和后續生活，也對新生兒家庭產生難以抹去的陰影，更給社會造成了巨大的負擔。現今，新生兒缺陷難以有效治療，所以臨床上多采取產前篩查的方法預防新生兒缺陷發生。大量研究已經證明，亞甲基四氫葉酸還原酶（RecombinantMethylenetetrahydrofolate Reductase， MTHFR） 基因是葉酸代謝通路中的關鍵代謝酶，亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷可以導致5- 甲基四氫葉酸合成減少，通過體內生化變化最終導致葉酸水平降低和發生高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，Hhcy）。同型半胱氨酸會影響破壞血管內皮，Hhcy 患者的凝血與纖溶系統常因平滑肌細胞受到血管內皮損傷的刺激而破壞，因此導致患者處于血栓前狀態。同型半胱氨酸也是許多疾病的獨立危險因素，主要在表現在婦幼保健篩查（ 如神經管缺陷、先天性心臟病、唇腭裂、妊高癥等）、腫瘤（ 乳腺癌、胃癌、肝癌、兒童急性白血病等）、心腦血管疾病三大主要方面。我們把工作的焦點放在婦幼保健，分析產檢孕婦的亞甲基四氫葉酸還原酶基因變異情況，同期結合遺傳、環境等多方面因素建立起本地區有關MTHFR 基因多態性與產前篩查相關性分析。這個檢測項目對于可能出現的高同型半胱氨酸和葉酸的異常代謝和缺乏給予適當的預防、適量的補充，有助于指導孕婦服用葉酸，降低唐氏綜合癥、唇腭裂、神經管缺陷等新生兒缺陷;做到早發現、早預防[1]。近些年來，亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR C677T） 多態性應用于產前篩查已初步通過驗證，但依據《醫學實驗室質量和能力認可準則》（ISO15189：2012， IDT）[2] 和《醫療機構實驗室管理辦法》的相關規定，在開展該項目前，必須行方法學驗證，以確保檢測結果的可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 MTHFR C677T 基因檢測樣本來自2017 年期間門診進行產前篩查的孕婦。樣本為EDTA 抗凝劑的靜脈全血，EDTA 抗凝劑的全血樣本所抽提的DNA 樣本（DNA 的濃度不低于5 ng/?L）A260/A280 應在1.6～2.0 之間。

1.2 方法 1.2.1 樣本DNA 的制備 按照全血基因組DNA 提取試劑盒使用說明書分離全血中的基因組DNA。

1.2.2 PCR 擴增液準備 ①取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，以便于為每份樣本分別進行兩種反應。②從-20℃的環境中將試劑取出并置于外界環境中升至室溫，瞬時離心。分別將29?L 擴增液（M）、擴增液（WT） 加入標記有M 和WT 的薄壁管中。③準確量取1?L 反應液分別加入上述兩個薄壁管中，其后將管蓋蓋緊并混合均勻，置于離心機中瞬時離心，其后取出放置一旁待用。

1.2.3 待檢測DNA 樣本的配制 分別準確量取3?L 對待測基因組DNA 加入上述離心后的兩個薄壁管中，為使混合后的體積達到50?L，應分別量取17?L ddH2O 加入薄壁管中，其后將管蓋蓋緊并混合均勻，置于離心機中瞬時離心以備后續操作。

1.2.4 PCR 擴增 打開PCR 儀并將PCR 管置于其中，依照50℃ 2 min;95℃ 5 min;94℃ 30 sec、60℃ 30 sec、65℃1 min（26Cycles）;65℃ 10 min;4℃ Hold 程序進行擴增。操作完成后，將擴增后的產物取出移至2℃～8℃環境中進一步保存以備后續操作。

1.2.5 檢測卡檢測實驗 從密封袋中取出檢測卡，分別在對應的樣品墊上滴加上述兩個薄壁管中的擴增產物，靜待2～5 min 判讀檢測結果，為保證結果的準確性，應確保在20min 內完成判讀。

1.2.6 結果判讀 將待測樣本M 與WT 管中的PCR 產物進行滴加檢測，在檢測結果中，C677T 位點的基因型主要是依據是否有條帶出現而判定的。具體觀察檢測卡T 線處是否有條帶，若兩管中的產物均有，為雜合突變型（677CT 型）;若WT 管產物有而M 管產物無，為野生型（677CC 型）;若M 管產物有而WT管產物無，為純合突變型（677TT 型）。無效判定：檢測卡變質或錯誤操作可導致指控線（C 線） 不出現條帶。針對上述情形，應更換合格的檢測卡并準確依照說明書進行再次操作。

1.2.7 質量控制 ①在陽性對照卡上有條帶出現則為陽性對照，反之，在陰性對照卡上無條帶出現則為陰性對照。應確保定期針對上述兩種對照品進行實驗。②陽性對照品實驗：取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，分別準確量取20?L M 陽性對照液與WT 陽性對照液加入相同標注管中，其后分別量取1?L 反應液+29?L M擴增液、1?L 反應液+29?L WT 擴增液加入對應的薄壁管中，并重復上述PCR 擴增、檢測、判讀步驟，條帶出現在T線與C 線處。③陰性對照品實驗：取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，分別量取1?L 反應液+29?L M 擴增液、1?L 反應液+29?L WT 擴增液加入對應的薄壁管中，準確量取20?L 陰性對照液加入其中，并重復上述PCR 擴增、檢測、判讀步驟，T 線處無條帶而C 線處有條帶。

對于檢測結果中，依據文獻和臨床研究報道：當MTHFRC677T 發生純合突變則酶活性降低，對葉酸的吸收代謝產生影響;MTHFR C677T發生雜合突變則酶活性中等，對葉酸代謝吸收產生一定影響;MTHFR C677T 不發生突變即野生型則酶活性高，葉酸代謝吸收正常。具體資料見表1。

2 結果

2.1 方法學性能評價

2.1.1 基因型各濃度樣本的檢出率 評價方案：選取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 雜合突變型）、MTHFR 677TT型（ 純合突變型） 樣本，分別檢測兩個不同濃度5 ng/μL 和10 ng/μL，按照不同濃度，上述三種基因型分別進行3 次檢測，統計各基因型各濃度樣本的檢出率。具體資料見表2。

判定標準：檢出率達100% 的最低樣本濃度即為本實驗方法的檢測下限。

驗證結果：濃度為5ng/uL 時，檢出率100%，條帶清晰、明確。

2.1.2 符合率實驗 評價方案：取已知MTHFR 基因型DNA 樣本20 例（ 覆蓋MTHFR 三種基因型），編盲后進行MTHFR 基因型檢測（ 在陰、陽性質控在控的情況下對結果進行評價分析），檢測結果與已知的第三方雙向測序結果比對，比較二者的符合率。

判定標準：總體符合率95% 為判斷標準。

驗證結果：共測序比對20 例。其中，CC 型6 例，CT 型7例，TT 型7 例。CC 符合率100%，CT 符合率100%，TT 符合率100%，總符合率100%。

2.1.3 精密度實驗 評價方案：選取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 雜合突變型）、MTHFR 677TT 型（ 純合突變型） 樣本，持續測試5 d，每個樣本每天重復3 次。

具體資料見表3。

判定標準：檢測每天重復結果，基因型符合率大于95%為判斷標準。

驗證結果：5 d 實驗結果比對總符合率100%。

2.2 本文性能驗證項目 采用PCR+ 金標免疫層析法的快速分析技術，以金磁微粒為標記載體，建立了MTHFR C677T基因快速層析檢測系統。在實驗室項目評估中，精密度指提示結果的一致性，準確度衡量結果與真值之間的關系，而好的精密度與良好的準確度相關。這兩者都是評估實驗室項目的重要組成部分。本次性能驗證的結果表明：該方法具有高精密度和符合率，在臨床應用中的安全性和有效性均能保證。該檢測方法與其他方法相比也擁有許多優勢。首先，該產品具有獨特的設計原理，不僅操作簡單，而且快捷，比芯片法節約近3 個小時，比測序法更節約時間，可以高通量測試，時間和人力成本明顯節約，結果準確，可以滿足大型醫療機構對基因型檢測樣本量較大的要求。UNG 酶的采用，避免了PCR 產物進行層析檢測過程中的污染發生。同時，該試劑盒使用過程中無需大型測序儀器，無需專業的生物芯片雜交儀和掃描儀等，只需要普通的PCR 測序儀，就可以完成對MTHFR C677T 位點的基因檢測，這一點也解決了三級以下醫院設備簡陋的問題，有利于檢測項目在小醫院的開展，很大程度也方便了孕婦進行產前檢查，有助于項目的普及。MTHFRC677T 多態性檢測試劑盒的性能驗證結果與廠商提供的數據基本一致。經性能驗證實驗證明該試劑盒基本滿足對產婦進行產前篩查的要求，可以應用于臨床檢測。

3 討論

婦幼保健方面，針對中國人的相關亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性主要集中在MTHFR 基因C677T 的位點多態性研究上[3-4]，這是毋庸置疑的。本報告雖然對實驗方法學性能作了評價，結果顯示檢測下限、符合率、精密度、準確性均符合要求。但臨床診斷性能包括臨床特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值、似然比、一致性等臨床診斷性能，這也是今后計劃工作的一部分。每一種實驗方法都存在假陰性和假陽性，假陰性高表示漏診率高。樣本采集的問題也是假陰性重要因素，而更應該引以關注的是某項指標陽性與實際發病的關系。實驗中也應盡可能繼續結合遺傳因素、環境回素、自身免疫狀況及食物營養等多因素與產前MTHFRC677T 基因檢測綜合分析新生及孕婦可能發生的各種狀況。

MTHFR C677T 突變與新生兒缺陷有關，但不是唯一的致病因素，MTHFR C677T 多態性檢測這一性能評價也僅僅是產前篩查的一個質量保證，多指標聯合檢測也是減少漏診的重要方法[5-6]。其結果的判讀應用在于提示同型半胱氨酸的升高和葉酸的降低，才能對可能出現的高同型半胱氨酸和葉酸的異常代謝和缺乏給予適當的預防、適量的補充，有助于指導孕婦服用葉酸，及時干預，對避免新生兒缺陷有重要意義。