干酪源生物活性肽的構效關系研究進展

楊保軍，梁琪*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室(甘肅農業大學)，甘肅 蘭州，730070)

干酪中蛋白質含量為25%～35%(質量分數)，且以酪蛋白為主(約占總蛋白含量的80%)，酪蛋白根據結構主要分為4種：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，比例為4∶1∶4∶1[1]。肽是蛋白質降解過程中暫存的中間產物，在干酪成熟期間蛋白質受到發酵劑乳酸菌自溶以及氨肽酶活性變化的影響，產生具有功能活性的小分子多肽[2]。乳源活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次為β-酪蛋白和αs2-酪蛋白，少部分來自κ-酪蛋白，一般由2～20個氨基酸發生縮合反應形成肽鏈，且分子質量<6 kDa[3]，按肽片段所含氨基酸個數可將其分為小肽(<7種氨基酸)、中等肽(7～25種氨基酸)和大肽(>25種氨基酸)。肽通常作為營養來源對機體健康產生積極影響，在調節人體心血管系統、神經系統、消化系統以及免疫系統等方面生理功效顯著[4]。肽的結構特征，如肽鏈長度、氨基酸組成、肽的物化特征(如氨基酸殘基的疏水性、分子電荷和側鏈)等都會影響其生物活性功能。但目前關于干酪源生物活性肽構效關系的研究仍然較少，且按照傳統方法篩選和表征干酪中蛋白質降解肽功能活性的時間較長。一些生物信息學網址、肽數據庫和蛋白質結構功能分析軟件等的使用極大縮短了肽功能活性預測和表征的周期。藥效團模型、分子對接等生物信息學技術是針對大規模小分子進行虛擬篩選的重要途徑，分子動力學模擬工具能夠動態描述分子的運動狀況，為分子水平解釋肽與受體蛋白相互作用提供理論參考。因此本文整理了以往文獻中關于干酪源生物活性肽功能活性與其所對應結構特征之間的構效關系，并就生物信息學技術在肽領域的應用做了闡述，以期為干酪源生物活性肽的篩選、功能活性預測、表征和深度開發利用提供理論依據。

1 干酪源多肽的產生

干酪是需要經過發酵成熟的乳制品，在干酪發酵成熟過程中蛋白質發生降解，干酪pH、鹽含量、成熟條件、發酵劑等均影響蛋白質降解[5]。蛋白質降解可分為兩步：(1)凝乳酶以及原乳中蛋白酶(纖溶酶和組織蛋白酶)降解乳中的αs-酪蛋白、β-酪蛋白，產生水不溶性大肽和水溶性肽[6]；(2)大肽和中等肽受細胞外、細胞包膜相關蛋白酶和發酵劑、附屬發酵劑蛋白酶降解形成小肽，細胞包膜裂解后釋放肽酶，肽酶促使小肽的降解和游離氨基酸的生成[7](圖1)。不同蛋白酶(不同切割位點)作用于不同類型的酪蛋白(不同水解方式)會產生多條不同氨基酸序列的肽段，肽的功能活性與肽的一級結構(肽鏈長短、氨基酸序列和組成、二硫鍵位置和數目)密切相關，因此不同干酪中蛋白質降解產生的生物活性肽具有豐富的種類和功能，尤其在促進人體健康、維持生理功能等方面具有重要作用[8]。

圖1 酪蛋白的降解途徑Fig.1 The degradation pathway of casein

2 干酪源肽的功能活性及其結構特征

許多研究表明，活性肽段在蛋白質氨基酸序列中以無活性狀態存在，但可通過酶解或微生物發酵等方式被釋放出來，發揮生物活性功能[9]。干酪蛋白質來源、蛋白質預處理方式(例如超聲和脈沖電場處理等)、肽酶的類型和水解條件等因素均會改變蛋白質水解產物的結構、功效以及所產生肽的類型[10]，表1為部分干酪水溶性提取物(water-soluble extracts, WSE)的功能活性及其所對應特征肽段的氨基酸序列。

表1 部分干酪水溶性提取物的功能活性Table 1 Functional activity of some cheese water-soluble extracts

2.1 ACE抑制活性與結構之間的關系

ACE含有維持活性的Zn2+和Cl-，是腎素-血管緊張素和激肽-激肽釋放酶2個體系的關鍵性酶[16]。ACE抑制肽一方面是指抑制ACE將血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ(可使血壓升高)轉換，另一方面是指抑制ACE對舒緩激肽的破壞作用，從而達到降血壓目的[17]。2000—2016年，人們相繼在Gouda干酪[18]、雙歧桿菌發酵制得的低脂肪Festivo干酪[19]、生牛乳制作的white-brined干酪[20]、市售的Cheddar干酪[21]和墨西哥Cotija干酪[22]中發現了降血壓肽。SAITO等[18]在檢測的眾多干酪(8-mo-aged 24-mo-aged Gouda, Emmental, Blue, Camembert, Edam, Havarti)中發現8個月齡的Gouda干酪肽段顯示出對收縮壓的最強抑制作用(-24.7 mm Hg)和對血管緊張素I轉化酶的強烈抑制活性(75.7%)。RYHANEN等[19]也觀察到同樣的現象，Festivo干酪中肽的ACE抑制活性隨著干酪成熟時間和蛋白水解程度的變化而變化。STEPHANIE等[12]對3種澳大利亞市售Cheddar干酪的肽提取物進行研究以后發現不同分子質量肽組分的IC50存在差異，與分子質量>10 kDa和分子質量>5 kDa的組分相比較，分子質量<5 kDa的肽組分具有更高的ACE抑制率。就肽的氨基酸鏈長短而言，ACE抑制肽一般含有2～12個氨基酸殘基[23]。大多數研究表明降血壓肽具有典型的N端和C端氨基酸殘基(例如N端含有甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，C端含有脯氨酸、酪氨酸和色氨酸)，這種結構有助于肽和ACE結合，而亮氨酸可以提高ACE抑制效果，從而起到更好的降壓作用[24]。此外，肽的疏水性也會對其ACE抑制活性產生重要影響，如果肽的親水性過高，則會使得ACE抑制肽無法接近ACE活性部位，從而導致其活性較弱或無活性。SOLEYMANZADEH等[25]鑒定出具有ACE抑制作用的肽MYDYPQR(MR7)，研究發現該肽含有4個疏水性氨基酸、2個極性氨基酸和1個帶電氨基酸，肽的疏水性達57.14%，顯示出適度的疏水性，由于肽與ACE活性位點的結合與疏水性氨基酸有著本質關系，造成MR7具有高的ACE抑制活性(0.002 3～0.027 g/L)。但ACE抑制肽的抑制能力顯然不能單純用肽鏈長短、肽的分子質量大小和氨基酸組成等來解釋，ACE抑制肽的一級結構不同，其空間構象也會有差別，這會影響肽與ACE活性位點的結合，進而影響其ACE抑制能力，因此ACE抑制肽的立體構象與其抑制能力的關系有待進一步研究。

2.2 抗氧化活性與結構之間的關系

抗氧化肽一般由5～16個氨基酸殘基組成，研究發現食源性抗氧化肽具有減緩人體衰老、降低人體癌癥患病率的功能，同時具有安全性強、水溶性好、致敏性低等優點[26]。肽的抗氧化性主要與其組成、結構和疏水性有關，王波[27]利用Caco-2細胞模型研究了肽組分的分子質量大小、電荷性、疏水性對肽在小腸上皮細胞吸收轉運以及生物利用度的影響，發現當肽組分分子質量<1kDa、帶有負電荷且是弱疏水性時，其吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度顯著。相關研究已經表明在意大利Stracchino軟質干酪[28]、新鮮山羊乳干酪[29]和Cheddar干酪[12-13]中發現了具有抗氧化作用的生物活性肽，Stracchino軟質干酪經胃腸系統消化后，六肽(例如EAMAPK和AVPYPQ)含量高，抗氧化活性強，水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均對結腸癌細胞產生的自由基具有抑制作用。大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如纈氨酸或亮氨酸，并且序列中含有脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸[30]，有研究者認為疏水性氨基酸的數量也會影響肽的功能活性，比如MENDIS等[31]研究發現當抗氧化肽中含有2個苯丙氨酸和其殘基時，該肽具有更高的抗氧化活性；同時還有研究表明，當抗氧化肽中含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸以及堿性氨基酸時，抗氧化肽的活性會相應增強[32]，比如在帶有芳香族氨基酸色氨酸的環狀抗氧化肽中，由于色氨酸具有提供活性氫供體的能力，所以該抗氧化肽的活性較大[33]。此外，肽的分子質量大小也是影響肽抗氧化活性的重要因素之一，TIMON等[34]的研究指出不同凝乳酶干酪中分子質量<3 kDa的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白。影響干酪源抗氧化肽抗氧化活性強弱的因素是多樣的，干酪中的抗氧化肽除了經人體消化產生外，主要源自干酪成熟過程中的蛋白質降解。分離、鑒定干酪中的抗氧化肽，探索干酪源抗氧化肽的形成機理和構效關系，對開發抗氧化肽含量高和抗氧化活性強的干酪產品具有積極作用。

2.3 抗菌活性與結構之間的關系

抗菌肽是由生物體產生的一種小分子陽離子型活性肽，來源廣泛，而且相對分子質量較小，具有生物活性功能的多肽長度大多集中在21～30氨基酸[35]。自1974年HILL等[36]用凝乳酶水解牛乳αs1-酪蛋白得到了第一個抗菌肽(Isracidine)以來，眾多學者相繼用胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽Casocidin-I和Trip等，用胃蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽(Cp1)(對應于αs1-酪蛋白99～109位殘基)和抗菌肽(Cp2)(對應于αs2-酪蛋白183～207位殘基)。BARZYK等[37]、SEDAGHATI等[38]研究發現肽的疏水性對抗菌活性有影響，抗菌肽的N末端富含親水性氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸等，C末端富含疏水性氨基酸殘基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常被酰胺化，這是抗菌肽具有抗菌活性的關鍵因素之一[26]。此外，抗菌肽結構的穩定性受肽鏈長度的影響，從而抑菌活性也受到肽鏈長度的影響。PHAMBU等[39]通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)、熱重分析(thermogravimetric analysis, TGA)及差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)研究表明理想的肽鏈長度(含有6個氨基酸殘基的肽)可以增加分子內氫鍵作用，從而保持肽鏈的穩定性，進而與陰離子的脂質更好結合，發揮更強的抑菌作用。THéOLIER等[14]研究了加拿大5種市售干酪(Mozzarella, Gouda, Swiss, old Cheddar，medium Cheddar)脫鹽純化的水溶性提取物后發現，只有Mozzarella和Gouda干酪的水溶性提取物對ListeriaivanoviiHPB28和大腸桿菌MC4100有明顯的抗菌作用。FONTENELE等[40]研究了Coalho干酪酪蛋白衍生肽的生物活性后發現，β-酪蛋白肽(193～209)具有免疫調節、抗微生物和降壓活性，β-酪蛋白(58～72)，β-酪蛋白(193～202)，αs1-酪蛋白(85～91)，αs1-酪蛋白(1～9)以及αs2-酪蛋白(189～197)是具有降壓活性的肽片段，αs1-酪蛋白(1～23)是一種具有免疫調節活性和抗菌活性的肽片段，這些結果被確定為巴西干酪的權威性標志。FIALHO等[41]借助MALDI-TOF/TOF、MASCOT Daemon與UniProt數據庫結合對3種市售Minas干酪中提取的可溶性肽進行測序和鑒定，發現起源于αs1-酪蛋白的肽序列PKHPIKHQ、RPKHPIKHQG、RPKHPIKHQGLPQ和RPKHPIKHQGLPQE是屬于Isracidine的片段，另外發現了2種β-酪蛋白衍生的新抗菌肽序列HQPHQPLPPT和MHQPHQPLPPT，但它們的生物學活性仍然未知。抗菌肽的抗菌活性很大程度取決于肽的結構特征(尤其是二級結構)，目前對不同酪蛋白來源干酪抗菌肽抗菌活性的研究比較多，但局限于一級結構且其構效關系并不十分清楚，結構生物學和生物信息學的發展為干酪源抗菌肽立體構象和抗菌活性關系的研究提供了技術支持。

3 生物信息學技術在肽領域的應用

肽的化學結構信息與其生物活性密切相關，多肽的氨基酸組成和序列信息對其生物活性具有重要影響[42]。隨著生物活性肽構效關系的深入研究，許多乳源蛋白質的一級結構和活性肽氨基酸序列得到闡明，但隨機選擇肽段研究其生物學活性和分子機制又具有盲目性。基于影響肽功能活性的結構特征和理化因素，可以借助一些生物信息學網址提供的軟件和藥效團模型等對大量肽片段進行虛擬篩選，利用分子對接和分子動力學模擬等生物信息學技術研究活性肽與受體蛋白之間相互作用的動態變化功過程和分子機制。表2為蛋白質降解肽理化分析時常用的生物信息學網址。

表2 肽功能活性研究時常用的在線生物信息學工具Table 2 Online bioinformatics tools commonly used in peptide functional activity research

4 總結和展望

綜上研究表明，干酪源生物活性肽的功能活性與肽段的分子質量大小、肽鏈長短、氨基酸序列及組成和疏水性等結構特征密切相關。近年來乳源生物活性肽在理論研究上表現突出，新序列的干酪源多肽不斷被發現，但由于種種原因并未真正應用到實際產品的生產加工過程中，且大部分活性肽的功能活性研究仍然局限于一級結構和體外模型，體內研究相對較少。因此，采用紅外光譜、核磁共振氫譜及圓二色譜等多種相關技術鑒定干酪源活性肽的二級結構，對構效關系進行更深入的體外研究，借助蛋白數據庫、肽數據庫和分子對接軟件等生物信息學方法和技術，從分子水平揭示不同生物活性功能肽段與受體蛋白之間相互作用的分子機制，將理論模擬與實驗過程有機結合，進一步探究干酪源生物活性肽的酶切位點和作用機理，通過動物實驗提高干酪源生物活性肽在機體內的靶向性和穩定性，這對確保其成功的作為功效因子開發制備功能食品，以此來改善人體健康具有重要意義。