氣相色譜-正化學源質譜法同時測定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

喬青青，郝莉花*，鞏凡，葛靜，方裕科

1(河南省產品質量監督檢驗院，河南 鄭州，450000)2(河南省食品安全數據智能重點實驗室，河南 鄭州，450000)3(仲愷農業工程學院，廣東 廣州，510000)

焦糖色素是一種世界廣泛使用的食品色素，占整個食品著色劑使用量的90%以上[1]，由于它具有棕褐色色澤、良好的口感和穩定性，被廣泛用于食醋、醬油、飲料和啤酒等水溶性食品中[2]。國際技術焦糖色素協會根據生產過程中所采用的反應劑把焦糖色素分為四類，分別為普通法(Ⅰ類)、苛性硫酸鹽法(Ⅱ類)、氨法(Ⅲ類)和亞硫酸銨法(Ⅳ類)[3]。其中，Ⅲ類和Ⅳ類焦糖色素在制作過程中會產生副產物4-甲基咪唑[4]。

4-甲基咪唑是具有多元毒性的化合物，其毒理學性質包括：抑制細胞色素P450同功酶、在人的肝臟中發生催化反應、產生許多低分子質量致癌物、誘發動物驚厥、導致甲狀腺腫瘤和白血病的風險[5-8]。因此，我國的食品安全國家標準中規定4-甲基咪唑的含量不得高于200 mg/kg，同時對不同食品中焦糖色的含量也進行了限定[3,9]。2-甲基咪唑是4-甲基咪唑的同分異構體，目前，國內外均未對這兩類甲基咪唑進行明確的限量規定，但其污染的風險性仍無法排除[4]。因此，準確測定焦糖色中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑十分重要。

檢測焦糖色素和食品中2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的方法主要有紙層析法、分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、氣相色譜-串接質譜法、液相色譜串接質譜法等。早期研究中所用的紙層析法以定性為主，定量誤差較大[10-11]。GB 1886.64—2015中規定4-甲基咪唑的檢測方法為氣相色譜法(火焰離子化檢測器，flame ionization detector，FID檢測器)。對于這種小分子化合物FID檢測器響應較差，當前毛細管色譜柱超量進樣又會導致進樣過載，峰寬大且嚴重拖尾，加之其他化合物對基線的影響，容易出現假陽性，定量不準確的問題。液相色譜法需要對樣品衍生，重現性較低[12]。

最近的研究將檢測重點轉移至質譜領域，所開發的方法較多，僅2019—2020年，在中文文獻中檢索到多篇串接質譜檢測2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的研究，其中5篇為液相串接質譜法。王穎等[13]采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆制品中3種甲基咪唑類化合物含量；王愛軍[14]采用氣相色譜串聯三重四級桿質譜測定焦糖色中4-甲基咪唑含量；王冰玉等[15]采用高效液相色譜法測定咪唑生產工藝中反應液中咪唑及2種雜質：2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；公丕學等[16]采用固相萃取UPLC-MS/MS測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；鈕正睿等[17]采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測保健食品中4-甲基咪唑含量。液相、氣相串接質譜法能夠有效排除雜質干擾，測定結果準確，雖然通用性好，但是儀器較昂貴，檢測成本高。相比串接質譜，氣相單級質譜也能測定[18]，但常用的電子轟擊電離(electron ionization，EI)源不具有選擇性，低分子質量的甲基咪唑容易受到多雜質干擾，繼而出現較多假陽性。與許多含氮化合物一樣，由于咪唑氮原子具有化學反應活性，因此可以采用具有特殊選擇性的離子源模式，如正化學源模式對少數含氮化合物有響應，對很多雜質沒有響應，可以消除多數無法離子化雜質的干擾[19-20]，不易出現假陽性。

本研究采用氣相色譜-正化學源質譜法檢測甲基咪唑，選擇適宜的前處理方式并優化前處理條件和儀器參數，建立了同時測定焦糖色中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法。該方法具有高度選擇性，能夠避免單擊質譜條件下雜質的干擾，獲得較好的檢出限和精密度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：2-甲基咪唑(純度99.4%)、4-甲基咪唑(純度99.1%)，Bepure公司；硅藻土，美國Supelco公司；焦糖色素(市售)；正己烷，美國Tedia公司；二氯甲烷(色譜級)，天津市恒興化學試劑制造有限公司；三氯甲烷(色譜級)、丙酮(色譜級)， 煙臺市雙雙化工有限公司；乙酸乙酯(色譜級)、乙腈(色譜級)，霍尼韋爾貿易(上海)有限公司；氫氧化鈉(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；三級水，實驗室自制。

儀器：Agilent 7200氣相色譜串聯質譜儀(配有可切換的EI、CI源)，美國安捷倫公司；Vortex Mixer QL-866旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FA2004 N電子天平，上海箐海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

在50 mL離心管中準確稱取(0.5±0.02) g焦糖色，加入250 μL氫氧化鈉溶液(氫氧化鈉水溶液3 mol/L)混合均勻。加入少量硅藻土，旋蓋后渦旋混勻，繼續添加硅藻土混勻直至形成半干、均勻的混合物(離心管壁上不粘有焦糖色)。上述混合物完全轉移至帶有砂芯漏斗的玻璃柱中，少許開啟旋塞，將洗脫溶劑傾倒至柱中，待溶劑通過色譜柱流至旋塞時關閉旋塞，溶劑停留在柱層中5 min。打開旋塞，繼續添加溶劑并收集洗脫液10～15 mL(控制流速5 mL/min)，并定容至20 mL，混合均勻；定容液過0.22 μm有機膜，置于進樣小瓶中，待上機。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：DB-WAXetr(30 m×320 μm×1 μm)。載氣：He；流量：2 mL/min；進樣口溫度：220 ℃。進樣模式：脈沖不分流。程序升溫：40 ℃保持1 min，5 ℃/min至115 ℃，后運行260 ℃(3 mL/min)保持5 min，傳輸線溫度：280 ℃。

1.2.3 質譜條件

離子源：化學源；模式：正模式(正化學電離，positive chemical ionization，PCI模式)；離子源溫度：300 ℃；發射電流：4.4 μA；電子能量：240 eV。采集模式：Scan，掃描m/z=35～100，采集頻率:5質譜圖/s。EI源根據文獻[14]中的條件設置。

1.2.4 標準溶液配制

準確稱量2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準品(0.01 g)，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制質量濃度為1 000 μg/mL標準儲備液D1；準確量取1.00 mL標準儲備液D1，用乙酸乙酯定容至100 mL，配制成10 μg/mL儲備液D2；量取50、100、200、400、800 μL儲備液D2，分別加入乙酸乙酯定容至1 mL，配制質量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL的標準溶液。

2 結果與分析

2.1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑質譜采集模式的研究

2.1.1 PCI模式

研究采用1.2.2色譜條件，分別用EI、PCI、負化學電離(negative chemical ionization，NCI)3種離子源模式電離并測定儲備液D2，獲得2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色譜圖(圖1)和質譜圖(圖2)。

由圖1可以看出，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑保留時間分別為8.480和8.992 min，EI模式下和NIST14庫匹配度>80%，化合物定性準確；PCI模式下，在相同保留時間仍可以發現峰形較好的2個峰，質譜圖(圖2)主要m/z為83、84、82，因此選擇m/z=83為定量離子，m/z=84和82為定性離子。

a-EI模式；b-PCI模式圖1 質量濃度為10 μg/mL的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色譜圖Fig.1 Chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the level of 10 μg/mL

a-EI模式下2-甲基咪唑；b-EI模式下4-甲基咪唑；c-PCI模式下2-甲基咪唑；d-PCI模式下4-甲基咪唑圖2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在EI、PCI模式下的質譜圖Fig.2 MASS chromatogram of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the mode of PCI-MS /MS and EI-MS/MS

2.1.2 PCI條件下MS/MS模式

采用1.2.2色譜條件，在PCI模式基礎上測定研究儲備液D2的MS/MS產物離子，優化碰撞能量5、10、15、20、25 V，最終得到產物離子最豐富的碰撞能量為15 V，產物離子圖見圖3。母離子m/z=83產生的子離子主要為m/z=42和56，因此，如果采用PCI模式串接三重四極桿質譜檢測，應選擇定量離子m/z=83→42(碰撞能量15 V)、定性離子m/z=83→56(碰撞能量15 V)。

a-2-甲基咪唑；b-4-甲基咪唑圖3 PCI模式下MS/MS產物離子圖Fig.3 The ion chromatograms in the mode of PCI

2.2 前處理方法的選擇與優化

2.2.1 洗脫劑的選擇

采用文獻[14]所述方法在樣品焦糖色中檢出98 mg/kg 4-甲基咪唑，2-甲基咪唑未檢出，因此本研究在樣品中添加100 mg/kg的2-甲基咪唑，制備待測樣品S1并對前處理的方法選擇和優化。

將制備的待測樣品S1，采用1.2.1所述前處理方法，選取不同種類洗脫劑(正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮)50 mL洗脫樣品并按照2.1.1所述PCI單極質譜方法檢測，以回收率為指標選擇合適溶劑，每組實驗重復2次，結果見表1。

由表1可以看出，正己烷無法洗脫待測物(回收率為0%)，因此不適合作為洗脫劑，但可用作復雜體系除脂。二氯甲烷作為洗脫劑時，對4-甲基咪唑回收率107.12%，2-甲基咪唑回收率僅為67.11%，因此不適合同時檢測2種化合物。

表1 洗脫劑種類對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率的影響(n=3)Table 1 Influence of different eluents on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯為洗脫劑時對2種化合物洗脫效果較好，但其中三氯甲烷毒性較大且產生較強的基質放大效應(回收率121.25%)，乙腈極性較大，洗脫后待測液顏色較深，均不適合作為洗脫劑。乙酸乙酯洗脫后回收率接近100%，溶劑毒性較小，因此選擇乙酸乙酯作為本研究的洗脫劑。此外，由于丙酮洗脫后焦糖色素大量溶出，無法產生有效凈化效果，因此不適合作洗脫劑。

2.2.2 洗脫液用量

采用乙酸乙酯作為洗脫劑，將制備的待測樣品S1，采用1.2.1所述前處理方法測定，并按照2.1.1所述PCI單極質譜方法檢測，考察洗脫液用量對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率，結果如表2所示。

表2 洗脫液體積對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率的影響(n=3)Table 2 Influence of different eluents volume on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

由表2可以看出，隨著洗脫液用量增加，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑回收率呈上升趨勢，超過10 mL時回收率接近100%，繼續增加溶劑的洗脫量不僅不會增加回收率，反而使精密度和回收率下降，這可能是因雜質的量增加而導致基質效應影響顯著導致。因此，本研究洗脫液體積選擇為10～15 mL。

2.2.3 線性范圍、定量限、精密度、回收率

配制0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準系列濃度進行測定，按照2.1.1所述PCI單極質譜方法檢測，以定量離子峰面積S為縱坐標，質量濃度ρ(μg/mL)為橫坐標繪制標準工作曲線，2-甲基咪唑標準溶液在0.5～0.8 μg/mL范圍內，線性回歸方程為y=10 099x+6 279，相關系數R2=0.999 7，4-甲基咪唑標準溶液在0.5～0.8 μg/mL范圍內，線性回歸方程為y=8 836x+8 824，相關系數R2=0.999 4，線性均較好。

按照3倍性噪比計算檢出限，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑儀器檢出限均為0.5 μg/mL，稱樣量為0.5 g，定容體積20 mL時，方法檢出限為20 mg/kg，滿足焦糖色中4-甲基咪唑含量的檢驗要求(限量值為200 mg/kg)。對2-甲基咪唑空白焦糖色樣品加標，考察了3個加標水平(20、80和320 mg/kg)，每個水平平行試驗3次(n=3)，計算測得樣品的加標回收率為102.1%～107.9%，通過相對標準偏差衡量試驗精密度，相對標準偏差值為1.33%～5.79%，具體見表3。

表3 焦糖色素中2-甲基咪唑加標回收率及相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and precisions of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in caramel pigment(n=3)

3 結論與討論

本研究采用氣相色譜-正化學源質譜法檢測甲基咪唑類物質，樣品經堿化處理后，用硅藻土凈化，10～15 mL乙酸乙酯洗脫，在0.5～8.0 μg/mL范圍內線性良好，該方法2種物質的方法檢出限均為20 mg/kg；在20、80、320 mg/kg 3個水平下，2-甲基咪唑的回收率為102.1%～107.9%，相對標準偏差(n=3)為1.33%～5.79%。

EI模式沒有選擇性，甲基咪唑類分子質量低容易受到雜質干擾，PCI模式對2-甲基咪唑及4-甲基咪唑都有較好的響應，對很多雜質沒有響應，可消除多數無法離子化雜質的干擾，不易出現假陽性。該方法簡單、快速、高效，可用于同時測定焦糖色素中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。