一株產香酵母Trichomonascus ciferrii的分離鑒定及其純種發酵豆豉的揮發性成分分析

文鶴，劉江崟，胡祥飛，李浩，楊慧林，王筱蘭*

1(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)2(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330027)

豆豉是我國一種傳統發酵豆制品，與天培(tempeh，印度尼西亞根霉型豆豉)、納豆(natto，日本細菌型豆豉)齊名，因其獨特風味受到廣大人們喜愛[1-2]。豆豉中揮發性風味成分主要有酯、醛、醇、酚、呋喃、吡嗪等物質，共同賦予豆豉酯香、醇香和醬香等風味。豆豉根據生產工藝主要分為霉菌型和細菌型，而霉菌型豆豉根據制曲菌種不同又可劃分為曲霉型、毛霉型和根霉型[3-4]，生產工藝、菌種及環境的區別導致不同類型豆豉揮發性成分種類及含量存在明顯差異[5]。這些揮發性成分除極少數來源于原料本身外，大多數是在生產加工過程中經不同微生物生長代謝產生的[6]。

我國豆豉生產工藝多沿襲傳統方法，采用自然發酵，主要包括制曲和發酵(后發酵)兩個階段，在開放式環境中制曲且后發酵時間長達半個多月，外界環境對其風味、品質影響較大[3,7]。自然發酵極易受氣溫影響，且生產周期長，開放式生產環境難以適應消費者對食品安全及衛生等方面要求，如何提高生產水平、穩定產品品質、實現工業化成為豆豉生產企業急需解決的難題。以往豆豉研究方向主要集中在可培養和非可培養微生物多樣性[8]，對豆豉風味物質是由何種功能微生物產生缺乏相關研究。豐富的風味物質與多種微生物生長代謝密切相關，此前本課題組已從豆豉中篩選獲得高產脂肪酶[9]、蛋白酶[10]、酒精[11]、乳酸[12]的菌株，這些產脂肪酶和蛋白酶的菌株能分解大豆中的大分子物質，生成甘油、脂肪酸、甘油單酯、二酯、氨基酸和糖類等風味前體物質，或者通過糖酵解作用直接形成乳酸、乙醇等風味物質，賦予豆豉特有的風味。通過篩選優良菌株進行豆豉純種發酵，對控制發酵參數、避免雜菌污染、縮短生產周期、實現工業化生產和改善品質及風味有著重要意義。

本研究擬從自然發酵豆豉中篩選獲得優良產香菌株，采用固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術(solid phase micro extraction-GC-MS，SPME-GC-MS)分析對比該菌株純種發酵豆豉與自然發酵豆豉中風味物質變化，對純種發酵豆豉品質及揮發性成分進行評價，以考察豆豉純種發酵生產的可行性，揭示曲霉型豆豉自然發酵生產過程中風味、功能微生物和核心功能菌群之間的相關性，為豆豉傳統生產和現代生產工藝結合奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲霉型豆豉，江西南昌稻香園調味食品有限公司；黑豆(符合食品加工要求)，市售；正構烷烴(C8～C40)混合標品，西格瑪公司；鄰氨基苯甲酸甲酯、苯甲酸甲酯(色譜純)，阿拉丁試劑有限公司；Yeast基因組DNA提取試劑盒，OMEGA公司。

腦心浸液肉湯培養基(brain heart infusion，BHI)(g/L)：葡萄糖2.0，蛋白胨10.0，脫水小牛腦浸粉12.5，脫水牛心浸粉5.0，NaCl 5.0，磷酸氫二鈉2.0。

1.2 儀器與設備

T100 PCR儀，BIO-RAD；固相微萃取裝置(包括手柄和DVB/CAR/PDMS萃取頭)，Supelco公司；PowerEase 90 W核酸凝膠電泳儀，Life technologies公司；7890A/5975氣相色譜-質譜聯用儀，Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

在同一生產周期內采集樣品，取后發酵的第1、5、9、13、19天的豆豉樣品，采集后用無菌的塑封袋密封，冰袋冷藏帶回實驗室進行下一步操作，置于實驗室4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 菌株的篩選與鑒定

1.3.2.1 菌種富集培養

分別取4 g以上5組豆豉樣品加到裝有10 mL無菌生理鹽水的試管中，渦輪振蕩5 min，吸取1 mL菌液接入裝有100 mL BHI培養基的錐形瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h。采用平板稀釋涂布法，分別取上述培養基中的菌液梯度稀釋至10-4～10-7，取100 μL分別均勻涂布到BHI培養基平板上，于30 ℃恒溫培養36 h，挑取不同菌落形態的菌株轉至斜面上，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2.2 分離純化

將篩選得到菌株在BHI培養基平板上劃線分離，在30 ℃恒溫培養箱培養24 h，重復劃線3次以上，在顯微鏡下觀察到形態單一的菌體則說明菌株已經分離純化。

1.3.2.3 菌株鑒定

將上述目的菌株劃線活化后，觀察菌落形態特征；對菌株進行革蘭氏染色，用光學顯微鏡觀察細胞形態；采用Yeast基因組DNA提取試劑盒并參照試劑盒內說明書提取總DNA。選用真菌通用引物ITS 1/ITS 4進行擴增。PCR反應體系50 μL[2]：Premix Taq 25 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、模板 1 μL、ddH2O 22 μL。熱循環參數:95 ℃預變性3 min，95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環30次，72 ℃延伸5 min。產物經電泳驗證PCR擴增成功后將產物送至上海生工進行測序，測序結果提交到GenBank獲得登錄號，在NCBI里進行Blast序列比對分析，然后通過MEGA 6.0軟件用領接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統進化樹。

1.3.3 豆豉采集

純種發酵樣品：用接種環挑取適量上述菌接種到裝有100 mL YPD液體培養基的錐形瓶中，30 ℃、180 r/min恒溫培養36 h，再將菌液(5×106CFU/mL)按10%接種量接種到經121 ℃、20 min蒸熟的市售黑豆中，不經過制曲環節，直接在燒杯中30 ℃恒溫發酵19 d。發酵結束，在燒杯上、中、下3層取樣(深度分別為5、10、15 cm，下同)，取樣后充分混勻，每份樣品采集3組。

自然發酵樣品：該豆豉是經過傳統工藝的制曲、洗曲階段后，在發酵池自然發酵19 d的樣品。在同一發酵池的上、中、下3層取樣，取樣后充分混勻，每份樣品采集3組。

1.3.4 SPME萃取揮發性成分

將DVB/CAR/PDMS萃取頭按照包裝里的說明書進行老化備用，將自然發酵第19天、純種發酵第19天的豆豉樣品(每個樣品設置3組重復)進行研磨，分析前取研磨后的豆豉樣品過40目篩。取3 g樣品，加入到20 mL頂空進樣瓶中，采用恒溫水浴加熱，60 ℃平衡20 min，將SPME裝置置于頂空進樣瓶上方，60 ℃恒溫萃取30 min，再采用GC-MS分析[13]。

1.3.5 標準曲線測定

取250 mg苯甲酸甲酯標品，100 mg鄰氨基苯甲酸甲酯標品，溶解于25 mL無水乙醇中配成母液，依次分別取1.25、1.00、0.833、0.714、0.625、0.50 mL的母液，分別加入一定量的乙醇，定容至5 mL。取全部上述溶液，采用1.3.4中揮發性成分SPME的條件進行萃取后，再采用GC-MS分析。采用標準曲線法計算樣品中目標物質的含量，以2.50、2.00、1.67、1.43、1.25、1.00 g/L質量濃度的苯甲酸甲酯為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作苯甲酸甲酯標準曲線；以1.00、0.80、0.67、0.57、0.50、0.40 g/L質量濃度的鄰氨基苯甲酸甲酯為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作鄰氨基苯甲酸甲酯標準曲線，測出樣品的峰面積后在標準曲線上查出其對應的濃度。

1.3.6 GC-MS分析條件

色譜條件參照文獻[14]：Agilent 19091S-433毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，分流進樣；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至85 ℃，10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源EI，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍35～400 amu。

1.3.7 成分鑒定及含量計算

定性分析：各樣品組分質譜信息與NIST08質譜庫進行檢索，初步確定化合物，采用樣品GC-MS分析條件進行正構烷烴C8～C40系列混合標品分析，根據文獻[15]中的方法計算線性保留指數(linear retention indice，LRI)，再與NIST數據庫中的線性保留指數進行比，對化合物定性進行進一步確認[14]。

定量分析：揮發性成分相對含量用峰面積歸一化法計算[16]；采用外標法對純種發酵豆豉中主要揮發性成分定量，用主要揮發性成分標準品的峰面積與其對應的濃度做標準曲線，根據標準曲線法計算樣品中目標物質的含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態特征

經過富集和分離純化，從自然發酵豆豉中分離獲得23株不同的菌株，經復篩得到1株產香能力較強的菌株，命名為WLW。通過菌落形態觀察，菌落直徑2～3 mm，奶油色，半球狀，大而隆起，表面較光滑，濕潤，不易挑起，有大量向下生長嵌入培養基的假菌絲；光學顯微鏡觀察顯示該菌株形成較長的藕節狀假菌絲。

a-菌落形態；b-顯微形態圖1 WLW在YPD培養基上的菌落形態及顯微形態Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of WLW on YPD medium

2.1.2 ITS序列及系統發育分析

將上海生工的測序結果上傳到GenBank，獲得登錄號MW509947.1，再將ITS基因序列在NCBI數據庫中進行Blast同源性比對。利用MEGA 6.0軟件進行多序列比對分析，用NJ法構建系統發育樹(圖2)。結果顯示菌株WLW與Trichomonascusciferrii(KY109915.1)的同源性達99%以上。綜合WLW菌株的形態學特征、生理生化特征及同源性和系統發育分析，將菌株WLW鑒定為Trichomonascusciferrii。將該菌株送至廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)進行保藏，保藏號為：GDMCC No.61319。

圖2 基于ITS序列構建的菌株WLW系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain WLW based on ITS sequence

2.2 純種發酵和自然發酵豆豉揮發性成分的總離子流色譜圖

純種發酵和自然發酵豆豉揮發性成分用SPME萃取后再通過GC-MS分析，得到樣品中揮發性成分GC-MS總離子流色譜圖。由圖3可知，色譜峰較均勻分布在0～40 min，并且豐度較高，說明GC-MS條件適宜[17]。SPME是根據萃取頭極性不同，通過相似相溶原理萃取不同的物質，李金林等[13]發現豆豉中揮發性物質極性成分占比較高，而DVB/CAR/PDMS萃取頭屬于中等極性，適用于萃取中等極性和極性化合物，這說明用DVB/CAR/PDMS萃取頭對豆豉樣品進行SPME萃取較為合適。由圖3-a可以看出，豆豉純種發酵的揮發性成分中有2種化合物的峰面積尤為突出，由圖3-b可以看出，豆豉自然發酵的揮發性成分中有3種化合物的峰面積較為突出。

2.3 純種發酵和自然發酵豆豉揮發性成分鑒定

采用NIST08質譜庫檢索和NIST數據庫比對，進一步確定檢測到的揮發性成分，結果如表1所示，純種發酵豆豉共檢測出44種揮發性成分，其中酯3種、酮2種、酚3種、醇12種、醛5種、酸5種、吡嗪7種、呋喃2種、芳香族3種、其他2種；自然發酵豆豉共檢測出87種揮發性成分，其中酯15種、酮7種、酚5種、醇10種、醛10種、酸10種、吡嗪10種、呋喃3種、芳香族6種、其他11種。

采用外標法對純種發酵豆豉中的主要揮發性成分進行定量分析，以外標物苯甲酸甲酯的質量濃度X(g/L)及其對應的峰面積做標準曲線為y=47 713 490.20x+126 056 260.05，R2=0.995，以外標物鄰氨基苯甲酸甲酯的質量濃度X(g/L)及其對應的峰面積做標準曲線為y=75 257 089.46x-25 853 586.18，R2=0.991，2種方法的線性較好且符合方法學要求。

2.4 純種發酵和自然發酵豆豉揮發性成分對比分析

純種發酵和自然發酵豆豉中揮發性成分種類、數量及含量變化如圖4所示。通過表1分析發現，在發酵19 d后，自然發酵豆豉形成的揮發物種類為純種發酵豆豉的1.98倍，峰面積總和也遠超純種發酵豆豉。自然發酵豆豉中各種類風味物質含量較為均衡，共同造就豆豉酯香、醇香和醬香等多層次風味特征，而純種發酵豆豉形成的44種風味物質中，酯類化合物相對含量高達81.66%，尤其是苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯2種風味物質格外突出。其中純種發酵豆豉中有9種風味物質在自然發酵豆豉中未檢出，但也僅為純種發酵總揮發性成分的1.38%，可能是在自然發酵豆豉中含量過低而未能檢測出。以上說明利用WLW菌株純種發酵豆豉工業化生產可行，雖沒有自然發酵豆豉揮發性成分種類多，但該菌株純種發酵豆豉能高產酯類化合物，賦予豆豉更濃郁的酯香、果香和花香。

表1 純種發酵和自然發酵豆豉中主要揮發性成分Table 1 The main volatile components in fermented Douchi by purebred fermentation and natural fermentation

續表1

a-揮發性成分數量變化；b-揮發性成分含量變化圖4 純種發酵和自然發酵豆豉中揮發性成分種類、數量及含量變化Fig.4 Chang in species, amount, and content of volatile compounds in fermented Douchi by purebred and natural fermentation

在自然發酵豆豉中揮發性成分主要為酸、醛、酚、醇，分別占總揮發性成分的36.49%、24.59%、11.41%、9.43%。酸、醇賦予豆豉甜香、果香、奶酪味、脂香、花香等有益風味。2-甲基丁酸和異戊酸分別占總揮發性成分的19.02%、13.44%，2-甲基丁酸具有辛辣的羊乳干酪味和愉快的水果香氣，異戊酸具有賦予豆豉甜香、果香、奶油香、漿果香等美好風味。酸類物質含量較高的原因可能是由蛋白質和脂肪分解產生的氨基酸、脂肪酸等大分子繼續分解產生小分子酸類風味物質造成的[18]，趙文鵬等[19]發現酸類化合物主要是在后發酵過程中產生的。醇類物質可由羰基化合物通過還原作用或微生物代謝生成[20]，大量酸類物質的存在可以和醇類化合物通過酯化反應形成酯類化合物，豆豉特殊風味是一個緩慢形成的過程[21]。李金林等[13]在研究曲霉型豆豉時發現酯類是后發酵過程中形成最多的一類物質，醛是大豆中脂肪氧化產物[18]，醛類化合物主要為苯甲醛和可卡醛，分別占總揮發物的15.70%和4.55%，苯甲醛是一種工業上常用的芳香醛，具有強烈的杏仁氣味，同時具有甜香、堅果香和櫻桃味等良好風味，可卡醛具有苦可可香、堅果香、烘烤香、甜香和青草香等良好風味。在自然發酵豆豉中酸、醛、酚、醇的含量占總揮發性成分的52.71%，共同組成豆豉特有的風味。

純種發酵豆豉中揮發性成分主要為酯、芳香族、呋喃、醇，含量分別為總揮發性成分的81.66%、5.86%、4.99%、4.61%，尤為突出的是酯類化合物中的苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯，分別占純種發酵豆豉總揮發性成分的60.49%和21.16%，二者之和超過80%，而二者在自然發酵中占其總揮發性成分的0.61%和0.23%，差異明顯。其中苯甲酸甲酯具有強烈的果香和花香，有晚香玉和依蘭依蘭似的香韻，天然存在于依蘭依蘭花、晚香玉花和丁香花中；鄰氨基苯甲酸甲酯具有強烈的果香和花香，天然存在于晚香玉、茉莉花、梔子花和橙花中。苯甲酸甲酯的峰面積高達(1 924.51±0.35)×105mAu·min，鄰氨基苯甲酸甲酯的峰面積也達到(673.21±5.56)×105mAu·min，分別代入上步相對應的標準曲線換算可得苯甲酸甲酯在1 g豆豉中的含量約為23.48 mg，鄰氨基苯甲酸甲酯在1 g豆豉中的含量約為2.06 mg，正是由于二者表現出強烈的花香和果香，純種發酵的豆豉中能直接聞到茉莉花香和晚香玉似的香韻。

自然發酵豆豉呈現復合風味，而純種發酵豆豉在風味方面表現出濃郁的酯香、果香和花香的特點，遠超自然發酵豆豉。市售的豆豉往往采用自然發酵工藝，不同甚至同一品牌的不同生產批次產品的風味和品質都有較大差別。雖然自然發酵豆豉有多層次味覺體驗，但不可控的生產工藝、粗放的生產環境可能造成豆豉霉變、口感風味下降甚至導致嚴重的食品安全問題[3]。通過添加菌種進行純種發酵、嚴格控制發酵工藝能有效解決以上問題，盡管純種發酵豆豉沒有自然發酵豆豉的多重味覺體驗，但可以通過篩選獲得自然發酵過程中優勢微生物和多菌種搭配改良產品營養和風味，為工業化大批量生產風味豆豉提供可能。

3 結論

本研究通過篩選分離得到1株產香酵母Trichomonascusciferrii，命名為WLW。利用WLW純種發酵豆豉19 d后，以自然發酵19 d的豆豉為對照，采用SPME-GC-MS分析2組樣品中揮發性成分，對純種發酵豆豉的品質進行評價。自然發酵豆豉共檢出87種揮發性成分，純種發酵豆豉共檢出44種揮發性成分，前者揮發性成分種類約為后者的1.98倍。自然發酵豆豉中各種類風味物質含量較為均衡，共同賦予豆豉酯香、醇香和醬香等多層次風味特征；而純種發酵豆豉中酯類化合物相對含量高達81.66%，其中酯類化合物中的苯甲酸甲酯和鄰氨基苯甲酸甲酯分別占總揮發性成分的60.49%、21.16%，苯甲酸甲酯在豆豉中的含量約為23.48 mg/g，鄰氨基苯甲酸甲酯在豆豉中的含量約為2.06 mg/g，二者都具有強烈的花香和果香等美好風味。利用該菌株純種發酵雖沒有自然發酵豆豉揮發性成分種類多，但純種發酵能高產酯類化合物，賦予豆豉更濃郁的酯香、花香和果香。自然發酵豆豉不可控的生產工藝、粗放的生產環境容易造成產品品質下降，甚至引發嚴重的食品安全問題，而純種發酵可控的發酵工藝和更濃郁的風味特征可以改良豆豉的品質，該菌株純種發酵工業化生產豆豉方案可行。豆豉風味物質的形成是由多種微生物代謝共同作用的結果，風味物質形成與功能微生物之間的關聯還需要在未來進行進一步的研究。