茯茶“金花”菌發酵豆粕轉化大豆異黃酮苷元的研究

上官修蕾，顧秋亞，余曉斌

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

豆粕是大豆榨油后的副產品，其中含有大量大豆異黃酮。大量研究表明，大豆異黃酮與人類健康密切相關，具有一定的抗氧化[1]、抗癌[2-3]、抗腫瘤[4]、降血脂[5]、緩解更年期綜合征[6]等生理活性。天然存在的大豆異黃酮共有12種，分為結合型糖苷和游離型苷元。以糖苷形式存在的大豆異黃酮，不能被人體直接吸收，必須水解成苷元才能被吸收并發揮其藥理活性[7]。目前報道的糖苷水解方法主要有酸水解法、堿水解法和酶解法。酸水解的效率很高，但強酸條件不易實現工業化，且存在一定的不安全因素；堿水解條件下苷元性質不穩定；而酶水解反應條件溫和，因而生物法轉化大豆異黃酮糖苷具有獨特的優勢[8]。

“金花”菌是中國傳統發酵黑茶-茯磚茶“發花”過程中的優勢菌[9-10]，具有抗氧化、調節血脂、逆轉動脈粥樣硬化、促進腸道健康等多方面促健康作用[11-12]。本研究選用傳統發酵茶中有益菌“金花”菌發酵豆粕，探討“金花”菌對豆粕發酵的影響，對比發酵前后苷元含量以及抗氧化活性的變化，以期對豆粕資源的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

由本實驗室從湖南安化不同茶廠較具代表性的茯茶樣品中分離純化“金花”菌若干株，并分別進行編號、保藏。

1.2 材料與設備

豆粕，寧波中瑞生物科技有限公司；大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素標準品，大連美侖生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；Synergy H4酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠。

1.3 培養基

梔子苷篩選培養基(g/L)：梔子苷1.0，谷氨酸鈉10.0，蛋白胨5.0，磷酸二氫鉀10.0，硫酸鎂0.5，瓊脂粉25.0。

土豆茶汁培養基：土豆洗凈，稱取80 g切丁，沸水煮20 min，4層紗布過濾得土豆汁300 mL；稱取茶葉(正山小種)40 g，沸水煮20 min，4層紗布過濾得茶汁100 mL；混勻后加蔗糖16 g，瓊脂粉10 g。

“金花”菌液體種子培養基(g/L)：大米粉60.0，黃豆粉40.0，蔗糖20.0，海水晶25.0，磷酸氫二鉀2.0。

發酵培養基(g/L)：豆粕100.0，蔗糖20.0，海水晶25.0，磷酸氫二鉀2.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 高產β-葡萄糖苷酶“金花”菌的篩選及鑒定

菌株初篩：將實驗室分離純化的不同“金花”菌分別點種于梔子苷平板上進行初步的篩選，根據菌落的生長情況及藍色圈的大小確定進一步篩選的菌株。

菌株復篩：將菌種在土豆茶汁平板上進行活化后接種至種子培養基(250 mL三角瓶，裝液量50 mL)，于30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養5 d得液體種子液。按10%接種量將種子液接種至發酵培養基(250 mL三角瓶，裝液量50 mL),于30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養3 d。測定豆粕發酵前后苷元含量，篩選出苷元質量濃度增量最大的菌株作為最優發酵菌株。

菌種鑒定：根據NCBI中冠突散囊菌的ITS rDNA、β-tubulin 和RNA polymerase基因序列設計引物，對待測菌株進行PCR擴增并測序，最后通過BLAST及多基因系統發育樹的構建確定其種屬[13]。

1.4.2 HPLC法測定大豆異黃酮糖苷及苷元含量

采用HPLC[14-15]測定發酵豆粕提取液中糖苷以及苷元含量，色譜條件：流動相為V(甲醇)∶V(0.2%磷酸)=50∶50，流速0.8 mL/min，柱溫37 ℃，檢測波長260 nm，進樣量10 μL。

樣品處理：發酵完成后，菌株發酵液中加入100 mL甲醇超聲提取30 min，布氏漏斗抽濾除去固形物得提取液，提取液旋蒸后加10 mL甲醇復溶，過0.22 μm有機膜后HPLC進行檢測?？瞻讓φ諡榘l酵培養基滅菌后不接菌，其他處理與發酵組保持一致。

標準曲線的繪制：分別精密稱取標準品大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素各20 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得標準儲備液2 mg/mL，然后分別從各標準儲備液中吸取1 mL，用甲醇稀釋至 10、20、25、50、100、200 μg/mL待測，以峰面積(y)為縱坐標，大豆異黃酮濃度(x)為橫坐標，對各組分濃度與峰面積關系進行回歸分析，分別繪制標準曲線(表1)。

表1 大豆異黃酮標準曲線Table 1 Standard curve of soybean isoflavone

1.4.3 發酵條件對豆粕異黃酮苷元轉化的影響

1.4.3.1 底物添加量對發酵結果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、菌液(種子液)接種量不變，分別按豆粕添加量為5%、8%、10%、12%、15%(質量分數)添加至發酵培養基中，于30 ℃，160 r/min 恒溫搖床培養3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質量濃度為指標，確定最佳底物濃度。

1.4.3.2 菌液接種量對發酵結果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量不變，分別按接種量為4%、6%、8%、10%、12%接種至發酵培養基中，于30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質量濃度為指標，確定最佳接種量。

1.4.3.3 發酵溫度對發酵結果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量、接種量不變，接種至發酵培養基中，于18、25、30、37 ℃恒溫培養箱培養3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質量濃度為指標，確定最佳發酵溫度。

1.4.3.4 發酵時間對發酵結果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量、接種量不變，接種至發酵培養基中，于30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養36、48、60、72、84 h，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質量濃度為指標，確定最佳發酵時間。

1.4.4 抗氧化活性的檢測分析

通過測定總還原力、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、DPPH自由基[16]以及總氧自由基清除能力，綜合評價發酵豆粕的抗氧化活性。

采用AGRAWAL等[17]的方法測定發酵液的總還原力；按照T-SOD試劑盒說明測定發酵液的T-SOD活力；按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明制作標準曲線和測定發酵液的DPPH自由基清除率，用從標準曲線上算得的相當于抗氧化劑Trolox的量來表示發酵液的DPPH自由基清除能力；參照FENG等[18]和ZHANG等[19]的方法測定發酵液的總氧自由基清除能力。

2 結果與分析

2.1 高產β-葡萄糖苷酶“金花”菌的篩選

在β-葡萄糖苷酶催化條件下，1分子的梔子苷會被水解生成1分子的葡萄糖和1分子的梔子苷元，梔子苷元與氨基酸反應生成梔子藍色素，可依據菌落背面或周圍顯現的藍色來篩選β-葡萄糖苷酶的菌株。

將從茯磚茶樣品中分離的“金花”菌分別點種于梔子苷平板，在以0.1%梔子苷為碳源的培養基上，“金花”菌都能生長，其中菌株JH-4、JH-6有藍色圈(圖1)，說明其具有較好的β-葡萄糖苷酶活性。

圖1 分離菌株菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated strains

挑取菌落生長及產酶能力較好的“金花”菌進一步試驗，考察不同菌株對豆粕中大豆異黃酮轉化能力的差異。從圖2中可以看出接種金花菌發酵后，豆粕中苷元含量均有較大幅度的提升，其中菌株JH-4轉化效果最好，大豆素和染料木素增量最高。因此選取菌株JH-4進行后續發酵實驗。

圖2 不同菌株發酵豆粕3 d后苷元質量濃度Fig.2 Aglycone concentration of soybean meal fermented by different strains for 3 days

2.2 菌種鑒定

測序結果在NCBI數據庫中進行Blast比對，下載與待鑒定菌株序列同源性達99%以上的已知分類地位的模式菌株，運用MEGA7的Neighbor-Joining法構建系統發育樹[20],如圖3所示，綜合形態學和分子鑒定結果，鑒定該菌為謝瓦曲霉[21]，命名為AspergilluschevalieriJH-4。

圖3 “金花”菌JH-4系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of “Jinhua” fungi JH-4

2.3 發酵條件對豆粕異黃酮轉化的影響

2.3.1 最佳底物添加量的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液按接種量10%接種至豆粕添加量為5%、8%、10%、12%、15%的發酵培養基中，30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養3 d后苷元質量濃度如圖4所示。數據表明，前期底物添加量較少時，隨著底物添加量的增多，可供菌株利用的營養物質也在增多，有利于菌體生長，對大豆異黃酮糖苷的轉化效果增強，因此對應苷元質量濃度呈現遞增趨勢；當達到最佳底物添加量后，再次添加底物，導致基質含量降低，菌體可利用的活性水含量降低，不利于菌體的生長，進而影響大豆異黃酮糖苷的轉化效果從而導致苷元質量濃度降低，因此選取12%作為最佳底物添加量。

圖4 不同底物添加量對苷元質量濃度的影響Fig.4 Effect of different substrate additions on the mass concentration of aglycones

2.3.2 最佳接種量的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液分別按4%、6%、8%、10%、12%接種量接種至發酵培養基中，30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養3 d后,苷元質量濃度如圖5所示。數據表明，前期菌體接種量較少時，菌體接入發酵培養基后，由于延滯期過長，不利于菌株產生β-葡萄糖苷酶，從而影響大豆異黃酮糖苷的轉化效果，導致苷元質量濃度偏低。增加菌體接種量，有利于縮短延滯期，使菌體迅速生長，有利于大豆異黃酮糖苷的轉化，縮短發酵周期。在最優接種量的基礎上增加菌體接種量，會導致可供菌株利用的營養物質減少，不利于菌體生長，因此對大豆異黃酮糖苷的轉化效果呈現下降趨勢，對應苷元質量濃度也相應降低，因此選取8%作為最佳菌體接種量。

圖5 不同接種量對苷元質量濃度的影響Fig.5 Effect of different inoculations on the mass concentration of aglycones

2.3.3 最佳發酵溫度的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液接種至發酵培養基中，于18、25、30、37 ℃恒溫培養箱培養3 d后,苷元質量濃度如圖6所示，發酵溫度為30 ℃時，苷元質量濃度最高，說明此溫度下適宜菌株生長，有利于異黃酮糖苷的轉化。因此選取30 ℃為最佳發酵溫度。

圖6 不同發酵溫度對苷元質量濃度的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperatures on the mass concentration of aglycones

2.3.4 最佳發酵時間的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液接種至發酵培養基中，30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養，分別測定發酵36、48、60、72、84 h后苷元質量濃度,如圖7所示，隨著發酵時間的推移，苷元含量不斷增加，當發酵72 h后苷元質量濃度達到最高，隨后出現降低趨勢。說明在發酵72 h后培養基中可供菌體利用的營養物質不足，導致菌體利用苷元，使苷元質量濃度下降，因此選取72 h作為最佳發酵時間。

圖7 不同發酵時間對苷元質量濃度的影響Fig.7 Effect of different fermentation times on the mass concentration of aglycones

2.4 豆粕發酵前后苷元含量及體外抗氧化能力變化

參照單因素試驗結果，將基礎發酵培養基中豆粕添加量改為12%，將活化好的謝瓦曲霉種子液按8%接種量接種至發酵培養基中，30 ℃，160 r/min恒溫搖床培養72 h，在此優化條件下進行豆粕發酵，并對發酵前后糖苷及苷元含量進行檢測，同時對發酵前后豆粕的抗氧化活性進行分析。

2.4.1 豆粕發酵前后液相色譜圖

由圖8可得知，未接菌發酵的豆粕苷元含量非常低，而發酵過后豆粕中糖苷含量顯著降低，苷元含量明顯升高，其中大豆素與染料木素含量均得到大幅度提升，說明菌株JH-4轉化效果較好。按1.4.2所述方法提取并檢測發酵前后豆粕中大豆異黃酮含量，發酵后大豆素增至292.94 μg/mL，染料木素增至309.82 μg/mL，分別比發酵前提高8.19和10.13倍；大豆苷從359.35 μg/mL降至30.91 μg/mL，轉化率為91.40%；染料木苷從373.64 μg/mL降至1.57 μg/mL，轉化率為99.58%。

圖8 豆粕發酵前后大豆異黃酮高效液相色譜圖Fig.8 HPLC of soybean isoflavones before and after fermentation of soybean meal

2.4.2 豆粕發酵前后抗氧化能力變化

以發酵上清液為樣品，未接菌培養基上清液為對照，測定豆粕發酵前后總還原力、T-SOD、DPPH自由基以及總氧自由基清除能力，結果如表2所示。數據表明，發酵后抗氧化能力得到大幅度提升，其中T-SOD 活力以及總氧自由基清除能力變化最明顯，綜合判斷，發酵后豆粕抗氧化能力明顯提高。

表2 豆粕發酵前后抗氧化能力變化Table 2 Changes of antioxidant capacity of soybean meal before and after fermentation

3 結論

茯茶“金花”菌在發酵過程中能產多種酶參與底物的轉化。研究者對實驗室保存的不同“金花”菌β-葡萄糖苷酶活力進行篩選并將其應用于豆粕的液體發酵，最終確定1株優勢菌AspergilluschevalieriJH-4。該菌在豆粕添加量12%，接種量8%，發酵溫度30 ℃，發酵72 h后大豆苷從359.35 μg/mL降至30.91 μg/mL，轉化率為91.40%；染料木苷從373.64 μg/mL降至1.57 μg/mL，轉化率為99.58%。大豆素增至292.94 μg/mL，染料木素增至309.82 μg/mL，分別比發酵前提高8.19和10.13倍。實驗證明，“金花”菌AspergilluschevalieriJH-4能夠有效轉化大豆異黃酮糖苷，有利于發揮豆粕中大豆異黃酮的生物活性，從而提高豆粕的利用價值。