腈水解酶重組菌的培養(yǎng)工藝及磁性固定化研究

商玉婷，龔勁松，王順治，陸震鳴，李恒，史勁松，許正宏*

1(江南大學 生物工程學院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 藥學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

煙酸又稱維生素B3，在生物體的生命活動中起著重要作用。煙酸具有抗氧化活性，可以保護蛋白質(zhì)免受UV-C輻射的損害[1]。食用含有煙酸的飲食可以降低牛、火雞或豬等的脂肪含量，從而改善肉質(zhì)[2]。此外，煙酸還可以作為原料來合成新的化學中間體，例如煙酰胺、6-羥基煙酸[3]等。

利用腈水解酶催化3-氰基吡啶制得煙酸具有產(chǎn)物純度高、反應(yīng)時間短、操作過程簡單的優(yōu)點。據(jù)報道，產(chǎn)腈水解酶的杜鵑紅球菌tg1-A6在55 ℃下能將130 mmol/L 3-氰基吡啶完全轉(zhuǎn)化為煙酸，煙酸的最高質(zhì)量濃度可達165.2 g/L[4]。FAN等[5]構(gòu)建了1株產(chǎn)重組腈水解酶的大腸桿菌，基因來源為RalstoniaeutrophaH16，該酶可以在20.8 h水解1 050 mmol/L 3-氰基吡啶，積累生產(chǎn)煙酸129.2 g/L。

通過罐上發(fā)酵培養(yǎng)可以提高細胞在培養(yǎng)基中的密度，從而提高產(chǎn)物的濃度和比細胞生產(chǎn)率[6]。相比常規(guī)細胞培養(yǎng)方法，罐上發(fā)酵技術(shù)能夠提高生產(chǎn)率、減少培養(yǎng)量和設(shè)備投資，并增強下游加工能力[7]。通過控制營養(yǎng)物的補料分批培養(yǎng)是實現(xiàn)高細胞密度發(fā)酵的最常用方法之一，其包括簡單間接反饋方法，例如恒pH培養(yǎng)策略、DO-stat策略、指數(shù)進料，或者根據(jù)葡萄糖需求量反饋補料等方法[8-9]。顧炳琛等[10]在腈水解酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵中采用pH調(diào)節(jié)策略，最終腈水解酶的最高活性可達到583.3 U/mL。

磁性固定化是通過使用磁性納米材料對酶、抗體或細胞等進行結(jié)合，從而實現(xiàn)通過磁場進行產(chǎn)物或細胞分離的一種固定化方法。磁性納米顆粒比表面積高且在外部磁場下易于分離[11]。與游離酶相比，固定在磁性納米顆粒上的酶對有機溶劑介導的變性具有更高的抵抗力[12]。而復合型磁性納米材料則是磁性納米粒子與特定的載體材料結(jié)合而設(shè)計的新型材料[13]。陽離子聚合物是復合磁性納米粒子常使用的材料，可以通過提供靜電力的表面修飾提高固定化效率[14]。

在前期工作中，本實驗室已成功構(gòu)建1株產(chǎn)重組腈水解酶的BacillussubtilispMA5-NITR，其最高酶活力為38.03 U/mL，可以催化3-氰基吡啶累積生產(chǎn)煙酸，質(zhì)量濃度達到295.46 g/L[15]。為了進一步提高B.subtilis來源的腈水解酶的產(chǎn)酶潛力和累積生產(chǎn)煙酸的能力，本文采用分批培養(yǎng)、恒速補料培養(yǎng)和恒pH培養(yǎng)等策略對重組菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，提高酶活力及生物量、降低生產(chǎn)成本，進一步運用氨基化核殼結(jié)構(gòu)磁性Fe3O4納米粒子對重組菌進行細胞固定化，以提高酶穩(wěn)定性，提升其轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。目前的研究可以為未來腈水解酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝及大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化合成煙酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

重組腈水解酶B.subtilispMA5-NITR(以下簡稱重組腈水解酶)為實驗室保藏，基因是惡臭假單胞菌來源的腈水解酶基因[15]。

1.1.2 試劑

酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂，OXOID/REMEL(英國)；氯化鈉、葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4·3H2O，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5；

TBG培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨12，KH2PO42.3，K2HPO4·3H2O 16.4，酵母粉24，葡萄糖10，甘油5；

補料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖800；

固體LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5，瓊脂20；

LB、固體LB培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min；TBG培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基于115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 酶活力檢測方法

酶活力定義：在標準條件下即30 ℃的反應(yīng)溫度下，1 min生成1 μmol煙酸或氨所需酶量為1 U。

取200 μL菌液在12 000 r/min下離心2 min，并用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌2次后收集靜息細胞，加入800 μL PBS緩沖液進行重懸并于30 ℃金屬浴反應(yīng)5 min。添加200 μL 3-氰基吡啶(500 mmol/L)后繼續(xù)反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后12 000 r/min下離心2 min。取10 μL反應(yīng)上清液如上述操作進行顯色反應(yīng)，測定酶活力。

1.2.1.2 HPLC分析

本研究中3-氰基吡啶和煙酸均使用HPLC(Dionex Ultimate 3000)進行分析。分析柱使用X-Bridge C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm；Waters)，0.02%流動相為60%的乙腈和40%的三氟乙酸(均為體積分數(shù))。液相分析的流速、柱溫和檢測波長分別設(shè)置為0.5 mL/min、30 ℃和268 nm。

1.2.2 罐上發(fā)酵

1.2.2.1 種子制備

將-80 ℃凍存的B.subtilispMA5-NITR于LB平板進行劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。然后按接種量2%轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮LB培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后作為種子液待用。

1.2.2.2 分批培養(yǎng)

發(fā)酵罐大小為7.5 L，裝有4 L無菌TBG培養(yǎng)基。將種子液按照10%的接種量接種至發(fā)酵罐中并添加卡那霉素(Kanamycin)(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)。控制發(fā)酵反應(yīng)溫度為30 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，溶氧不低于30%(體積分數(shù))，并流加消泡劑。定時取樣檢測發(fā)酵液的菌液濃度、酶活力、pH、殘余葡萄糖濃度。

1.2.2.3 恒速補料培養(yǎng)

首先按照1.2.2.2進行分批培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中流加25%(體積分數(shù))氨水，控制pH不低于7.0。當檢測到殘余葡萄糖基本消耗完時進行補料，補料速率為3.6 mL/h。

1.2.2.4 恒pH培養(yǎng)

采用恒pH培養(yǎng)法進行補料，在發(fā)酵前期進行分批培養(yǎng)，當發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖基本消耗完后根據(jù)pH變化進行反饋補料。發(fā)酵前期，葡萄糖流加速率為20%，同時流加25%氨水使pH維持在7.0左右；發(fā)酵中期，葡萄糖流加速率為15%，同時流加氨水使pH維持在7.0左右；發(fā)酵后期，葡萄糖流加速率為5%，同時流加氨水使pH維持在7.0左右。此外，補料全程維持葡萄糖質(zhì)量濃度在1～5 g/L，發(fā)酵中后期通過增加通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速來保證溶氧供給。

1.2.3 制備Fe3O4磁性納米粒子

1.2.3.1 制備Fe3O4納米粒子

采用化學共沉淀方法[16]，進行Fe3O4磁性納米粒子制備。具體步驟如下：FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照1∶8的摩爾比溶解于100 mL的超純水中，并在N2下攪拌混勻。然后滴加氨水到混合溶液中，至pH為11。在70 ℃下反應(yīng)1 h后，置于室溫下冷卻。通過外加磁場將產(chǎn)物從溶液中分離，并用蒸餾水反復洗滌至pH變?yōu)橹行浴Ｗ詈笥谑覝叵抡婵崭稍铮@得Fe3O4納米粒子。其主要反應(yīng)過程為[17]：

Fe2++Fe3++OH-→Fe(OH)2/Fe(OH)3(形成共沉淀);

Fe(OH)2+Fe(OH)3→FeOOH+Fe3O4(pH≤7.5);

FeOOH+Fe2+→Fe3O4+H+(pH≥9.2)。

1.2.3.2 制備Fe3O4@SiO2納米粒子。

取4 g制備好的Fe3O4納米粒子，加入160 mL乙醇，40 mL水和5 mL氨水，超聲分散1 h后在室溫下進行機械攪拌，同時緩慢滴加1 mg/L正硅酸乙酯(tetraethoxysilane，TEOS)至混合溶液中。反應(yīng)12 h后，通過外加磁場將產(chǎn)物從溶液中分離，蒸餾水反復洗滌至pH變?yōu)橹行浴Ｈ缓蠹尤?0 mL 1 mol/L的HCl，過夜浸泡，外加磁場進行分離，并用蒸餾水洗滌至中性，最后于室溫下真空干燥，獲得Fe3O4@SiO2的納米粒子。

1.2.3.3 制備Fe3O4@SiO2@PEI納米粒子

取1 g Fe3O4@SiO2加入到含有100 mL超純水的錐形瓶中，超聲分散1 h后加入20 mg/mL的聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI，分子量10 000)，N2保護下持續(xù)攪拌，反應(yīng)8 h后，利用外加磁場分離，除去多余未反應(yīng)的PEI，再超聲分散于超純水中，最后室溫下真空干燥，即可得到經(jīng)PEI修飾的氨基化核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4納米粒子，即為Fe3O4@SiO2@PEI，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 制備磁性固定化細胞

1.2.4.1 制備方法

重組腈水解酶10 000 r/min離心5 min后去上清液，使用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌3次后重懸制備成靜息細胞懸液，使用分光光度計測定菌液濃度后放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將制備的Fe3O4@SiO2@PEI按照一定比例加入到重組腈水解酶靜息細胞懸液中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)20 min后利用外加磁場除去未吸附上磁性納米粒子的菌體。充分洗滌后測定菌液濃度，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

吸附效率計算如公式(1)所示：

吸附效率/%

(1)

1.2.4.2 制備條件對固定化細胞的影響

(1)靜息細胞濃度：將制備好的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子按照1 g/L進行分裝，并添加PBS進行重懸，然后超聲分散1 h。并將靜息細胞按照比例添加至磁性固定化細胞中，分別稀釋到1～11 g/L。

(2)溫度：分別在20～60 ℃下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細胞懸液中制備磁性固定化細胞。

(3)pH：分別在pH 4.0～9.0環(huán)境下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細胞懸液中制備磁性固定化細胞。

測定不同靜息細胞濃度、溫度及pH下固定化細胞的吸附效率和酶活力，研究不同制備條件對磁性固定化細胞的影響。

1.2.4.3 磁性固定化細胞的性能評價

(1)細胞溫度穩(wěn)定性：將磁性固定化細胞分別置于4、30、40、50 ℃條件下進行孵育，定時取樣測定酶活力直至酶活力降低至初始水平的一半。以初始固定化細胞酶活力作為對照，以殘余酶活力的自然對數(shù)對時間進行作圖并計算固定化腈水解酶在不同溫度下的半衰期。

(2)底物耐受性：將50～400 mmol/L的3-氰基吡啶分別加入到固定化細胞和游離細胞體系中進行酶催化反應(yīng)。通過不同3-氰基吡啶濃度下磁性固定化細胞和游離細胞酶活力的變化來評價底物耐受性。

(3)初始底物濃度影響：在相同體積的體系中，分別添加50～400 mmol/L的3-氰基吡啶進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。每5 min取樣，檢測磁性固定化細胞對不同濃度底物的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.5 磁性固定化細胞批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸

使用制備好的磁性固定化細胞進行對3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化實驗。每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，每轉(zhuǎn)化10批次，通過磁場分離磁性固定化細胞和產(chǎn)物，并將磁性固定化細胞轉(zhuǎn)入新的體系進行下一輪批次轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的罐上發(fā)酵

2.1.1 分批培養(yǎng)

通過分批培養(yǎng)策略研究重組菌的pH變化、酶活力、葡萄糖濃度和菌液濃度變化情況，分析影響重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的因素，為后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化提供參考依據(jù)。由圖1可知，在發(fā)酵初始階段，生物量較低，重組菌處于遲緩期，發(fā)酵罐內(nèi)pH基本維持恒定；發(fā)酵中期，重組菌達到對數(shù)期，菌體開始快速生長，此時酶活力也隨著重組菌生物量的提高而快速升高，在36 h時菌液濃度達到最高，OD600為19.27，同時酶活力也達到最大值為63.41 U/mL；隨后重組菌進入穩(wěn)定期中后期，此時發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖基本消耗完畢，發(fā)酵pH持續(xù)增加；在發(fā)酵末期，pH進一步升高，達到8.0以上，重組腈水解酶的酶活力開始出現(xiàn)明顯降低。

圖1 重組B.subtilis pMA5-NITR分批培養(yǎng)Fig.1 Batch mode of fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.2 恒速補料培養(yǎng)

在發(fā)酵過程中進行補料流加，可以有效補充細菌生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。由于葡萄糖廉價易得，并且能夠被微生物快速利用，因此被廣泛用作重組菌罐上發(fā)酵的限制性基質(zhì)為微生物生長提供能源[18]。黃燕等[19]通過恒速補料培養(yǎng)的方法提升了角質(zhì)酶的表達水平，在OD600為75時，進行恒速流加0.8 g/(L·h)的乳糖溶液，重組菌在24 h達到最高(OD600為90)，酶活力在26 h達到最大為4 788 U/mL，是搖瓶發(fā)酵酶活力的28倍。

因此，待初始葡萄糖基本消耗完畢后對重組菌進行補料，葡萄糖流加速率為3.6 mL/h。由圖2可知，開始補糖后重組腈水解酶的對數(shù)生長期顯著延長。在63 h前，重組菌的酶活力和菌液濃度隨著時間的增加而升高，酶活力在66 h達到最大值，為125.62 U/mL，是分批培養(yǎng)的1.98倍。菌液濃度在75 h達到最大值，OD600為55.80，是分批培養(yǎng)的2.9倍。

圖2 重組B.subtilis pMA5-NITR恒速補料培養(yǎng)Fig.2 Constant-speed feed fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.3 恒pH培養(yǎng)

由恒速補料培養(yǎng)可知，發(fā)酵中后期由于葡萄糖流加速率有限，無法及時滿足重組菌生長繁殖所需，使菌體生長減慢，產(chǎn)酶受到限制。采取調(diào)控更加精細的恒pH培養(yǎng)策略，對重組腈水解酶進行發(fā)酵，有望進一步提升菌體的產(chǎn)酶潛力。

如圖3所示，發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖在24 h時基本消耗完畢，此時開始補加葡萄糖。在進行補料之后葡萄糖濃度相對較為穩(wěn)定，60 h后葡萄糖質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定在1.2 g/L。重組菌菌液濃度隨著時間延長而穩(wěn)步上升，并在84 h時達到最高(OD600為58.85)，是分批培養(yǎng)的3.05倍，隨后開始緩慢下降。重組B.subtilis在發(fā)酵51 h時有最高酶活力，為167.32 U/mL，是分批培養(yǎng)的2.64倍，隨后酶活力開始下降。90 h后酶活力快速降低，96 h時酶活力約為80 U/mL，在108 h時終止發(fā)酵。

圖3 重組B.subtilis pMA5-NITR恒pH培養(yǎng)策略Fig.3 Feeding fermentation in pH-stat strategy of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.2 重組腈水解酶的磁性固定化

2.2.1 靜息細胞濃度對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

將1 g/L的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子分別添加到1～11 g/L的靜息細胞中進行混合，并按照1.2.4制成磁性固定化細胞。結(jié)果如圖4-a所示，在靜息細胞質(zhì)量濃度為3 g/L時，吸附效率最高，可達到69%，隨著靜息細胞濃度的升高，吸附效率逐漸降低。固定化細胞酶活力隨靜息細胞濃度的增加而升高，在5 g/L時達到最高酶活力，之后隨著靜息細胞濃度的升高，吸附效率開始下降，而酶活力也隨之降低。因此，5 g/L為最佳靜息細胞吸附濃度。

2.2.2 溫度對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

為了評估溫度對磁性固定化細胞的制備和酶活力的影響，在20～60 ℃下制備磁性固定化細胞。結(jié)果如圖4-b所示，在55 ℃之前，磁性納米粒子對細胞的吸附效率隨著溫度的升高而提高，在55 ℃時達到最大吸附效率為76%，而當溫度超過55 ℃，吸附效率開始下降。酶活力在50 ℃之前隨著溫度的升高而增加，并在50 ℃達到最大，然后隨著溫度的升高而降低。考慮到腈水解酶的穩(wěn)定性，選擇相對較高的30 ℃作為后續(xù)研究溫度。

2.2.3 pH對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

不同pH條件會影響到磁性納米粒子和菌體表面的帶電情況，并影響到兩者之間的吸附效率。將靜息細胞和磁性納米粒子在不同pH的緩沖液下進行復合，如圖4-c所示，當pH較低時，磁性固定化細胞的吸附效率較低，且隨著pH的升高而增大。當pH在7.2時有最高吸附效率為67.33%，然后隨著pH的升高而逐漸下降。酶活力受pH的影響較大，在pH 4.0～4.6基本完全喪失酶活力，然后隨著pH的上升而升高，并在pH 7.2時有最高酶活力。之后酶活力隨著pH的升高而下降，并在pH為8.9時基本完全喪失。同時磁性固定化細胞的酶活力受緩沖液的影響較明顯，在PBS緩沖液中酶活力最高。

a-不同靜息細胞質(zhì)量濃度；b-不同反應(yīng)溫度；c-不同反應(yīng)pH圖4 不同制備條件對磁性固定化細胞及酶活力的影響Fig.4 Effect of different preparation conditions on the magnetically immobilized cells and enzyme activity

2.2.4 磁性固定化細胞的溫度穩(wěn)定性

設(shè)置不同的溫度孵育磁性固定化細胞，以殘留酶活力(residual enzyme activity,RA)的自然對數(shù)ln(RA)對時間進行作圖。初始固定化細胞酶活力設(shè)定為相對活性的100%。由圖5-a可知，固定化細胞在4 ℃下最為穩(wěn)定，其半衰期(t1/2)達到140 h。在30 ℃下相對較穩(wěn)定，半衰期(t1/2)為15 h。在40、50 ℃ 下保存6 h后，酶活力僅有初始酶活力的29%和5%。和游離細胞相比，磁性固定化細胞在4 ℃下的半衰期提高了2.33倍。

2.2.5 磁性固定化細胞的底物耐受性

底物耐受性是反映酶催化能力的重要指標，良好的底物耐受性可以使酶催化承受更高的底物濃度，提高酶的催化效率和重復使用能力。據(jù)報道，產(chǎn)腈水解酶的固定化重組大腸桿菌可以將1 mol/L 3-氰基吡啶完全催化為煙酸，其底物耐受性和穩(wěn)定性得到顯著提升[20]。

在相同反應(yīng)體系中，分別在磁性固定化細胞和游離細胞反應(yīng)液中添加50～400 mmol/L終濃度的底物，檢測底物耐受性。結(jié)果如圖5-b所示，隨著底物濃度的升高，游離細胞酶活力快速降低，在添加100 mmol/L終濃度的底物時酶活力僅有相對酶活力的59%，在300 mmol/L終濃度底物下基本完全喪失酶活力。磁性固定化細胞在200 mmol/L以下隨著底物濃度的升高酶活力逐漸提高，并在200 mmol/L終濃度底物下表現(xiàn)出最高酶活力，然后隨著底物濃度的繼續(xù)升高而逐漸降低。在400 mmol/L終濃度底物下，磁性固定化細胞仍保留有60%的酶活力。磁性固定化細胞的底物耐受性比游離細胞顯著提升。

2.2.6 初始底物濃度對磁性固定化細胞轉(zhuǎn)化能力的影響

在相同體系下，分別添加50～400 mmol/L不同初始濃度的底物。結(jié)果如圖5-c所示，50和100 mmol/L的底物在5 min內(nèi)即可完全轉(zhuǎn)化完畢，當?shù)孜餄舛冗M一步提高，轉(zhuǎn)化時間相應(yīng)延長，400 mmol/L的底物需要60 min才能完全轉(zhuǎn)化。考慮到轉(zhuǎn)化效率，后續(xù)批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸實驗采用200 mmol/L終濃度的底物進行轉(zhuǎn)化。

2.3 磁性固定化細胞批次轉(zhuǎn)化

每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，游離細胞在轉(zhuǎn)化10批次后殘余酶活力約為初始酶活力的20%，產(chǎn)物抑制較為明顯。因此每轉(zhuǎn)化10批次，通過磁場分離磁性固定化細胞與產(chǎn)物，對固定化細胞進行重復使用結(jié)果如圖6所示。

a-磁性固定化細胞的溫度穩(wěn)定性；b-磁性固定化細胞和游離細胞的底物耐受性；c-初始底物濃度對磁性固定化細胞轉(zhuǎn)化能力的影響圖5 磁性固定化細胞的性能評價Fig.5 Performance evaluation of magnetically immobilized cells

圖6 磁性固定化細胞批次轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸Fig.6 Batch conversion of magnetic immobilized cells to produce nicotinic acid

前10個批次3-氰基吡啶可以在8 min之內(nèi)轉(zhuǎn)化完畢，第11～20批次底物能夠在15 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，第21～30批次底物能夠在20 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，并檢測不到底物殘留，最終煙酸累積質(zhì)量濃度達到738.66 g/L，是目前已有報道的B.subtilis腈水解酶生產(chǎn)煙酸的最高水平。據(jù)報道，DONG等[21]對腈水解酶產(chǎn)生菌惡臭假單胞菌CGMCC3830進行復合固定，該固定化細胞可以轉(zhuǎn)化14批次3-氰基吡啶，并積累煙酸達418 g/L。

經(jīng)過酶活力測定，在轉(zhuǎn)化30批次底物后，磁性固定化細胞仍然保留40%酶活力，而游離細胞僅能完成一輪批次轉(zhuǎn)化，酶活力就顯著喪失。和游離細胞相比，磁性固定化細胞對3-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化速率大大提升，前期是游離細胞的3.75倍。通過磁場快速分離產(chǎn)物后轉(zhuǎn)入新的體系仍能繼續(xù)進行批次轉(zhuǎn)化，最終累積生成煙酸濃度是游離細胞的2.5倍。

3 結(jié)論

本文分別使用分批培養(yǎng)、恒速補料培養(yǎng)以及恒pH培養(yǎng)等不同策略對重組腈水解酶產(chǎn)生菌B.subtilispMA5-NITR進行發(fā)酵培養(yǎng)。其中恒pH培養(yǎng)的策略效果最佳，重組菌最高OD600為58.85，是分批培養(yǎng)的3.05倍；最高酶活力為167.32 U/mL，是分批培養(yǎng)的2.64倍。靜息細胞質(zhì)量濃度5 g/L、反應(yīng)溫度30 ℃、pH 7.2是重組腈水解酶的最佳磁性固定化條件。相較于游離細胞，磁性固定化細胞的底物耐受性明顯提升。按照200 mmol/L的批次底物投料濃度，磁性固定化細胞能在450 min內(nèi)完全轉(zhuǎn)化30批次底物，煙酸累積質(zhì)量濃度達到738.66 g/L，是目前報道的B.subtilis腈水解酶生產(chǎn)煙酸的最高水平，并且轉(zhuǎn)化完畢后仍能保留40%的酶活力。本研究對于提升腈水解酶轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸的工藝經(jīng)濟性具有重要意義，有望為其潛在工業(yè)應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。