植物激素誘導和鹽脅迫對花生發芽期間白藜蘆醇含量變化的影響

饒桂維

(浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州，310015)

白藜蘆醇是植物體內用于抵抗病原侵染的一種二苯乙烯非黃酮類多酚物質，是一種天然的芪類化合物[1]。1940年日本學者首次從毛葉藜醇的根部分離得到白藜蘆醇[2]，白藜蘆醇一直是研究的熱點。如楊蘭澤等[3]經過實驗得出白藜蘆醇可以清除體內過多的氧自由基，有效地延緩衰老。近年來對白藜蘆醇的藥理研究發現其具有抗腫瘤[4-5]、降低血糖[6]、保護心血管[7]、抗氧化[8]、抗真菌和抗炎等作用[9-12]。研究者還發現白藜蘆醇對SARS-cov-2引起的肺炎有抗病毒活性[13]，研究表明白藜蘆醇具有能直接或間接作用于腫瘤發生、發展和轉移各個過程中多種途徑的關鍵靶點[14]。因此，它被譽為繼紫杉醇之后的又一個綠色抗癌藥物。

目前從植物提取白藜蘆醇主要來源于虎杖、桑葚、花生和葡萄等[15-17]。研究顯示花生在發芽后，其白藜蘆醇含量增大，如TONG等[18]采用木屑為培養基，培養Palgwang品種的花生到45 d，測得反式白藜蘆醇的含量為19.62 μg/g；康潔等[19]研究發現，花生萌發后在胚軸為3和5 cm時白藜蘆醇含量增加最大；付詩鳴等[20]研究發現花生發芽后總酚的含量是發芽前的1.7倍。對植物種子萌發的前處理會影響種子萌發率、自身活性物質含量等[21]，常用的前處理方式有：超聲處理、微波處理、激素處理[22]、干旱脅迫和鹽脅迫處理等[23]。于淼[24]采用超聲脅迫提高了花生種子中白藜蘆醇合成酶的活性和基因表達，促進了白藜蘆醇的生成。目前還無綜合研究微波、植物激素和鹽脅迫對花生萌芽期白藜蘆醇變化的文獻報道。我國花生資源十分豐富，并且廉價易得，故研究花生發芽期其白藜蘆醇含量變化和各種脅迫方式對其影響，探尋提高花生白藜蘆醇含量的培養條件具有廣闊的應用前景。本文采用高效液相色譜法監測花生發芽期其白藜蘆醇的含量變化，采用微波、植物激素和鹽脅迫等方式研究花生發芽期間其白藜蘆醇含量變化，并用得到的最佳條件培養10種不同產地的花生，得出白藜蘆醇含量最高的花生品種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：10種花生采購于電商，置于-18 ℃下貯存，備用。

白藜蘆醇標準品(純度>98%)，阿拉丁公司；色譜甲醇，美國天地公司；無水乙醇，分析純，國藥集團；吲哚乙酸、吲哚丁酸、水楊酸、阿魏酸、丁香酸、KCl、CaCl2、ZnCl2、CuCl2、NH4Cl、FeSO4、K2SO4、ZnSO4、Na2SO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3和(NH4)2S2O8皆為國產分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(包括UV230II紫外-可見檢測器、P230II高壓恒流泵、LU230II低壓梯度混合器)，大連依利特分析儀器有限公司；UPWS超純水器，杭州永潔達凈化科技有限公司；LG10-2.4A高速離心機，北京時代北利離心機有限公司；L6S紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；PL402-L電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；JK-100超聲波清洗器，合肥金尼機械制造有限公司；C型30玻璃儀器快速烘干器，長城科工貿有限公司；DGG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白藜蘆醇色譜測定

白藜蘆醇高效液相色譜條件[25]：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流動相為水∶甲醇(體積比55∶45)；檢測波長：306 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。

1.3.2 白藜蘆醇標準曲線的繪制

準確稱取白藜蘆醇標準品5.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即為500 mg/L的儲備液。標準使用液：將標準儲備液逐級稀釋成0.5、1.0、5.0、25.0和50.0 mg/L的白藜蘆醇標準使用液。在“1.3.1”色譜條件下，測各濃度標準使用液的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 花生芽中白藜蘆醇的提取

采用農業標準 NY/T 2641—2014 植物源性食品中白藜蘆醇的測定高效液相色譜法[25]進行處理：稱取經拭干水的30 g花生芽樣品，加入60 mL無水乙醇后在高速組織搗碎機中提取2 min，將混合液倒入燒杯中超聲再提取30 min后，倒入離心管中4 000 r/min的離心機中離心10 min，取上層清液，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.4 不同發芽時間花生芽中白藜蘆醇含量變化

取適量山東改良海花1號花生經消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設置3組，每組750 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環境下發芽，每天澆水，取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.3.5 微波輻射脅迫對花生芽中白藜蘆醇含量影響

取適量山東改良海花1號花生經消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設置3組，每組180 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環境下發芽，每天澆水，在第4天時各取30 g用110 W微波[20]0，30，60，90，120，150 s進行輻射，第2天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.3.6 植物激素誘導對花生發芽期白藜蘆醇含量影響[26]

考察常見的植物激素如吲哚乙酸、吲哚丁酸、水楊酸、阿魏酸和丁香酸對花生的萌發影響，尤其是花生發芽期白藜蘆醇含量的變化，以及找到花生發芽期白藜蘆醇含量最高的激素種類及濃度。取適量山東改良海花1號花生經消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設置3組，每組450 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環境下發芽，每組每天淋相應濃度(25～500 mg/L)生長激素溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.3.7 鹽脅迫對花生發芽期間白藜蘆醇含量影響

分別將KCl、CaCl2、ZnCl2、CuCl2、NH4Cl、FeSO4、K2SO4、ZnSO4、Na2SO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3和(NH4)2S2O8配制成0.5 g/L溶液，取適量山東改良海花1號花生經消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設置3組，每組450 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環境下發芽，每組每天淋相應濃度鹽溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.3.8 不同鹽濃度脅迫對花生發芽期間白藜蘆醇含量影響

經上述1.3.7下13種鹽脅迫實驗，得到最佳的脅迫鹽種類，進行不同濃度鹽脅迫因素實驗，配制含該鹽0、0.5、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的溶液，取適量山東改良海花1號花生經消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設置3組，每組540 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環境下發芽，每組每天淋相應濃度鹽溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.3.9 最佳脅迫因素下對花生發芽期間白藜蘆醇含量影響

通過對比植物激素脅迫和鹽脅迫對花生芽中白藜蘆醇含量的大小，選取最佳的脅迫方式和參數，對采集到的10種花生品種進行脅迫培養實驗，在同一條件下培養到第5天時取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測定含量。

1.4 數據分析

以上指標均取3個平行樣品，重復測定3次。采用Excel軟件統計進行數據處理和Origin繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇標準曲線的繪制

通過實驗求得各濃度下的標準品濃度與峰面積之間的關系,為y=71.127x-33.678,線性擬合結果R2=0.999，結果表明該標準曲線線性較好，白藜蘆醇質量濃度在0.5～50 mg/mL線形良好。

2.2 發芽時間對發芽花生中白藜蘆醇含量的影響

通過24 d的監測，計算得出山東改良海花1號花生芽白藜蘆醇含量隨發芽時間變化的曲線，如圖1所示。由圖1可知，該種花生芽在生長到第19天到第23天期間白藜蘆醇含量明顯高于其他時期，其中第20天白藜蘆醇含量出現最大值，達到了5.3 mg/100g，其次是第22天，白藜蘆醇含量達到了5.1 mg/100g。同時發現，在發芽時間為第5天時出現了一個前18 d發芽期的高峰，白藜蘆醇含量達到了1.51 mg/100g,本研究基于培養消耗成本及時間成本考慮，選定培養花生發芽測定其中白藜蘆醇的的最佳時間為發芽的第5天。本項目后續測量各種脅迫因素影響花生芽中白藜蘆醇含量的時間為發芽期第5天。

圖1 白藜蘆醇含量隨花生發芽時間變化的影響Fig.1 Effect of peanut germination time on resveratrol content

2.3 微波輻射脅迫對花生芽中白藜蘆醇含量的影響

微波輻射脅迫對花生芽中白藜蘆醇含量影響結果如圖2所示。經發芽培養的花生芽樣品經過功率為100 W，時間為30～150 s微波處理后，測定得到花生芽中的白藜蘆醇含量為1.2～1.6 mg/100g，相比于未經微波處理的花生芽白藜蘆醇含量(1.5 mg/100g)無顯著提高，證明微波促進作用甚微，從培養成本考慮，本研究后續的實驗皆不采用微波脅迫方法。

圖2 微波時間對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.2 Effect of microwave time on resveratrol content duringpeanut germination

2.4 植物激素誘導對花生發芽期白藜蘆醇含量的影響

各不同質量濃度的阿魏酸、水楊酸、丁香酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸對花生發芽期間白藜蘆醇含量的影響見圖3～圖7。5種酸的單因素試驗結果表明：阿魏酸在200 mg/L時白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；水楊酸在100 mg/L時白藜蘆醇含量最高為1.74 mg/100g；丁香酸在200 mg/L時白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；吲哚乙酸在300 mg/L時白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；吲哚丁酸在100 mg/L 時白藜蘆醇含量最高為1.7 mg/100g。而不添加上述植物激素溶液的花生芽對照樣品中白藜蘆醇的含量為1.51 mg/100g，采用水楊酸在100 mg/L濃度脅迫的花生芽中白藜蘆醇含量是對照樣品的1.15倍。由此可見，這些植物激素皆能促進花生發芽期間白藜蘆醇含量的增加。變化趨勢是白藜蘆醇的峰面積先隨植物激素濃度升高而升高，后隨其濃度升高而下降。表明適當的植物激素濃度能刺激花生芽白藜蘆醇的產生，而過高的濃度則會抑制花生芽代謝生成白藜蘆醇。

圖3 水楊酸質量濃度對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.3 Effect of salicylic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

圖4 丁香酸質量濃度對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.4 Effect of syringic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

圖5 吲哚乙酸質量濃度對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.5 Effect of indoleacetic acidconcentration on resveratrol content during peanut germination

圖6 吲哚丁酸質量濃度對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.6 Effect of indolebutyric acid concentration onresveratrol content duringpeanut germination

圖7 阿魏酸質量濃度對花生發芽白藜蘆醇含量影響Fig.7 Effect of ferulic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

2.5 鹽脅迫對花生發芽期間白藜蘆醇含量影響

本實驗選取了5種鹽酸鹽、4種硫酸鹽和2種碳酸鹽以及1個磷酸鹽和1個過硫酸鹽來進行鹽脅迫實驗。由表1可知，不同種類的鹽溶液對花生發芽到第5天時的生長狀態不盡相同，KCl、CaCl2、K2SO4和Na2SO4培養的花生芽在顏色和光澤和不用鹽脅迫培養的花生芽基本一致，為白色淺綠。而CuCl2和FeSO4培養的花生芽一個呈淺灰黑色，一個表皮黑色。其他鹽類多淺綠色。從芽的形態和狀態看，除了ZnCl2、CuCl2、Na2SO4培養的花生芽相對對照芽顯得芽頭小，而FeSO4鹽脅迫的花生芽芽干細長、發芽率低。而(NH4)2S2O8脅迫培養的花生芽芽干粗壯，發芽率高。從白藜蘆醇含量來看，經各鹽脅迫后，花生芽中的白藜蘆醇含量普遍得到增加。采用同濃度的CuCl2與(NH4)2S2O8溶液培養花生種子時，花生中的白藜蘆醇含量增加最多，約為正常培養的花生的1.2倍。但由于CuCl2含重金屬離子Cu2+，具有毒性，且培養的花生芽十分短小，而(NH4)2S2O8為氧化劑，且培養出來的花生芽較為粗壯，考慮到環境及在花生中的殘留問題，我們采用(NH4)2S2O8做后續的濃度實驗。

表1 不同鹽類處理對花生發芽白藜蘆醇含量影響Table 1 Effects of different salt treatments on resveratrol content during peanut germination

2.6 不同濃度(NH4)2S2O8對花生發芽期間白藜蘆醇含量的影響

得到最佳鹽種類之后，配制質量濃度為0、0.5、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的(NH4)2S2O8溶液，并分組進行培養該花生種子，提取，進樣。由圖8可知，促進白藜蘆醇含量增加的最佳鹽溶液的質量濃度為2.5 g/L，白藜蘆醇的含量為同批次正常花生的3.5倍。

圖8 過硫酸銨濃度對花生芽白藜蘆醇含量變化影響Fig.8 Effect of ammonium persulfate concentration on resveratrol content during peanut germination

2.7 用所得最佳條件培養10種不同產地的花生發芽白藜蘆醇含量結果

綜合上述微波脅迫、植物激素種類脅迫和鹽種類脅迫結果，本實驗采用配制2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液來對采集到的10種花生進行發芽培養。由表2可知，采用2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液脅迫培養的花生芽中白藜蘆醇含量為8.22～13.32 mg/100g。各品種花生芽白藜蘆醇含量與品種緯度無明顯關聯。而江蘇省大白沙花生的白藜蘆醇含量最高達到了13.32 mg/100g，是云南紅皮花生的白藜蘆醇含量8.22 mg/100g的1.62倍。山東平度富硒黑皮花生及云南七彩花生雖粒徑較小，但總體上含量均高于其他品種花生。

表2 用2.5 g/L的 (NH4)2S2O8溶液培養10種花生白藜蘆醇含量Table 2 resveratrol content of culture by ten peanut species with mass fraction of 2.5 g/L (NH4)2S2O8solution

3 結論

花生發芽期間的白藜蘆醇含量隨時間有變化：結果表明，在花生生長第20天白藜蘆醇含量出現最大值，并且在第5天出現小峰值。該文通過單因素試驗探究了微波輻射對花生發芽期間白藜蘆醇含量的影響，結果表明微波輻射對促進白藜蘆醇含量的效果一般。此外，通過單因素試驗研究了不同濃度的5種激素對花生中白藜蘆醇含量的影響差異，得出激素處理促進白藜蘆醇含量增加的最佳條件為：水楊酸在100 mg/L質量濃度脅迫的花生芽中白藜蘆醇含量是對照樣品的1.15倍。該文還研究了13種鹽類對花生發芽期間白藜蘆醇含量的影響，基于綠色環保的理念，得出最佳鹽類為(NH4)2S2O8及其最佳質量濃度為2.5 g/L，該條件下培養的花生中白藜蘆醇含量是正常花生中的3.5倍。采用2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液培養10個品種的花生，江蘇省高產大白沙花生發芽期的白藜蘆醇含量最高，達到13.32 mg/100g。