α-法尼烯在巴斯德畢赤酵母中的生物合成

劉慧，陳勝玲，徐建中*，張偉國(guó)*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

倍半萜類(lèi)化合物在醫(yī)藥、化妝品、調(diào)味品和生物能源方面具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。法尼烯是植物產(chǎn)生的最簡(jiǎn)單的無(wú)環(huán)倍半萜之一，在蘋(píng)果皮中分布豐富[3]。但是，它的天然合成受到植物生長(zhǎng)的嚴(yán)重限制，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求[4]。因此，研究人員已經(jīng)努力設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞工廠以生產(chǎn)法尼烯[5-9]。最近，已經(jīng)在大腸桿菌[5]、釀酒酵母[6]和解脂耶氏酵母[7-9]中通過(guò)設(shè)計(jì)代謝工程來(lái)生產(chǎn)法尼烯。與這些宿主相比，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成本低、周期短、表達(dá)量高且可高密度培養(yǎng)，具有大規(guī)模生產(chǎn)α-法尼烯的潛力。一些研究已經(jīng)證明，巴斯德畢赤酵母是生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的合適宿主[10]。然而，目前沒(méi)有報(bào)道描述巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的異源生產(chǎn)。

在本項(xiàng)研究中，首先成功構(gòu)建了產(chǎn)α-法尼烯的巴斯德畢赤酵母重組菌株。然后揭示了巴斯德畢赤酵母甲羥戊酸途徑和α-法尼烯合成途徑中限速步驟。之后對(duì)限速酶組合過(guò)表達(dá)并優(yōu)化基因拷貝數(shù)以平衡代謝途徑逐步提高α-法尼烯產(chǎn)量。最后通過(guò)外源添加不飽和脂肪酸促進(jìn)α-法尼烯分泌到細(xì)胞外，在搖瓶中最終獲得α-法尼烯產(chǎn)量約1.40 g/L[0.32 g/g 細(xì)胞干重(dry cell weight，DCW)]。這些策略提供了增強(qiáng)巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯生產(chǎn)的有效方法，并為其他增值化學(xué)品的生物生產(chǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母S288C、大腸桿菌DH5α、野生型巴斯德畢赤酵母X33、大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒PGAPZA，購(gòu)自Invitrogen。

1.2 試劑與儀器

限制性?xún)?nèi)切酶，Thermo Scientific；TaqDNA聚合酶、DNA Marker、DNA切膠回收試劑盒、T4DNA連接酶，TaKaRa；PCR引物、質(zhì)粒快速提取試劑盒，上海生工；酵母基因組提取試劑盒，康為世紀(jì)；博來(lái)霉素、遺傳霉素，Invitrogen；標(biāo)準(zhǔn)品β-法尼烯、玻璃珠，Sigma；正十二烷，羅恩試劑；油酸、硬脂酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸、棕櫚油酸均為國(guó)藥分析純。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；真空冷凍干燥機(jī)，日本Toshiba公司；高效氣相色譜儀，日本Shimadzu公司；電脈沖基因轉(zhuǎn)移儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉5；YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；BMDY培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，YNB 13.4，生物素0.5，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L (pH 6.0)。

1.4 重組質(zhì)粒以及菌株的構(gòu)建

表1和表2列出了該研究中使用的巴斯德畢赤酵母重組菌株和質(zhì)粒。利用GENEWIZ對(duì)來(lái)自蘋(píng)果(Malusdomestica)的α-法尼烯合成酶(α-farnesene synzyme，AFS)基因(Gene ID：103446592)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化和合成。所有酶表達(dá)載體均基于PGAPZA載體插入了相應(yīng)表達(dá)基因。ERG10，ERG13，ERG12，ERG8，ERG19，IDI1，ERG20分別從巴斯德畢赤酵母X33基因組中擴(kuò)增相應(yīng)基因。tHmg1從釀酒酵母S288C中擴(kuò)增被截短的HMG1(Gene ID：854900)。AFSLERG20是AFS和ERG20的融合基因，兩個(gè)基因之間用GSG 3個(gè)氨基酸連接。重組質(zhì)粒通過(guò)使用AvrII酶切線性化然后將其整合到巴斯德畢赤酵母X33基因組上。

表1 本研究使用的菌株Table 1 The strains used in this study

表2 本研究中使用的質(zhì)粒Table 2 The plasmids used in this study

1.5 巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選

按照J(rèn)OAN等[11]的方法進(jìn)行巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和電穿孔。30 ℃、90 r/min復(fù)蘇1 h，涂在含有100 mg/L博來(lái)霉素或者400 mg/L遺傳霉素G418的YPD板上以篩選重組菌落。使用酵母基因組提取試劑盒提取酵母基因組，并通過(guò)PCR驗(yàn)證基因整合到基因組中。

1.6 細(xì)胞干重測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心棄上清液，用清水洗滌2次后于烘箱中90 ℃烘干至恒重,得到菌體干重。

1.7 α-法尼烯含量的測(cè)定

按照LIU等[9]的方法進(jìn)行α-法尼烯含量的測(cè)定。收集兩相培養(yǎng)物的上層有機(jī)相，并以12 000 r/min離心10 min以去除細(xì)胞碎片，然后使用日本Shimadzu GC-2010 Plus配備有火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜儀，以1∶20的分流比進(jìn)樣，并在db-17色譜柱(30.0 m×0.32 mm，0.25 μm)上分離出1 μL樣品。烤箱溫度最初在80 ℃下保持1 min，然后以15 ℃/min的速度升至245 ℃保持1.5 min，以相同的速度升溫至280 ℃后運(yùn)行時(shí)間為5 min。氦氣用作載氣，入口壓力為96 kPa。探測(cè)器溫度保持在250 ℃。通過(guò)比較樣品和β-法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行定量分析。

1.8 重組畢赤酵母搖瓶培養(yǎng)

將重組菌接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)17 h作為種子液。以10%接種量接種于50 mL BMDY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為10%正十二烷來(lái)收集α-法尼烯。不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚油酸(均為液態(tài))，直接加入培養(yǎng)基中。飽和脂肪酸包括硬脂酸和棕櫚酸(均為固體顆粒)，為保證其在培養(yǎng)基中能夠均勻地分散，將其溶于200 μL無(wú)水乙醇后進(jìn)行添加，因此對(duì)于飽和脂肪酸，對(duì)照組應(yīng)加入200 μL的乙醇。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，分別測(cè)定α-法尼烯產(chǎn)量和菌體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯生物合成途徑的構(gòu)建

通過(guò)GENEWIZ對(duì)來(lái)源于蘋(píng)果的法尼烯合成酶基因(AFS)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化和合成。構(gòu)建了組成型表達(dá)質(zhì)粒PGAPZA-AFS，通過(guò)AvrII將其線性化并整合到巴斯德畢赤酵母的基因組中從而獲得重組菌株F1。僅使用少量線性化質(zhì)粒(500 ng/80 mL 細(xì)胞)來(lái)確保單拷貝整合的通用性[12]。將重組菌株在BMDY培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，其中分別覆蓋體積分?jǐn)?shù)為10%的十二烷以收獲產(chǎn)物。GC/GC-MS分析表明(圖1)，在菌株F1中觀察到法尼烯產(chǎn)量為(451.13±18.92) mg/L。先前的研究表明，來(lái)源于蘋(píng)果的α-法尼烯合成酶在大腸桿菌中α-法尼烯的產(chǎn)量為1.56 mg/L[3]，在釀酒酵母中為4 mg/L[20]，在解脂耶氏酵母中為0.13 g/L[9]。研究結(jié)果表明，重組畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量是遠(yuǎn)高于其他宿主。這可能是與巴斯德畢赤酵母外源蛋白表達(dá)水平高，高密度培養(yǎng)特性有關(guān)[21]。此外，菌株之間的生產(chǎn)能力差異很大也突出了巴斯德畢赤酵母合成α-法尼烯的優(yōu)越性。

a-氣相色譜圖；b-質(zhì)譜圖圖1 重組菌株F1合成的α-法尼烯氣相色譜以及質(zhì)譜圖Fig.1 GC/GC-MS of α-farnesene synthesized by recombinant strain F1

2.2 揭示甲羥戊酸途徑和α-法尼烯合成途徑中的限速步驟

截短的HMG1(tHmg1)基因可以有效解除膽固醇合成途徑中麥角固醇等的反饋抑制[13]，過(guò)表達(dá)tHmg1通常認(rèn)為是有益于類(lèi)異戊二烯在酵母中生產(chǎn)[14]。為了改善α-法尼烯在畢赤酵母中的生物合成，在菌株F1基礎(chǔ)上成功地過(guò)表達(dá)tHmg1得到菌株F2。菌株F2顯示α-法尼烯的產(chǎn)量達(dá)到(0.53±0.01) g/L，比F1中觀察到的產(chǎn)物水平提高約18%。

研究表明，tHmg1與甲羥戊酸(mevalonate ，MVA)途徑以及α-法尼烯合成途徑其他基因的共過(guò)量表達(dá)可能會(huì)使α-法尼烯的產(chǎn)量進(jìn)一步提高[15]。在此，將tHmg1分別與MVA途徑與α-法尼烯途徑(圖2)中涉及到的8個(gè)基因ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20、AFSLERG20進(jìn)行組合過(guò)表達(dá)(圖3)，并探究對(duì)α-法尼烯合成的影響，從而確定了限速步驟。所有的基因都整合到畢赤酵母的基因組中，并以強(qiáng)組成型啟動(dòng)子PGAP表達(dá)。與菌株F2相比，菌株F7、F8、F10、F11的α-法尼烯濃度增加了約37.13%～55.24%(圖3)。在F10/F11中，tHmg1和AFSLERG20組合過(guò)表達(dá)顯示最高的α-法尼烯產(chǎn)量為(0.70±0.03) g/L，其次是tHmg1和IDI1/ERG19組合過(guò)表達(dá)。然而，F(xiàn)11是在F10中額外過(guò)表達(dá)AFS，幾乎沒(méi)有增加α-法尼烯的產(chǎn)生，說(shuō)明此時(shí)AFS可能不是α-法尼烯合成途徑中的限速基因。同時(shí)tHmg1與ERG8/ERG10/ERG12/ERG13/ERG20基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致α-法尼烯產(chǎn)量?jī)H產(chǎn)生細(xì)微的變化(圖3)，可能是由于過(guò)表達(dá)導(dǎo)致中間體的積累和途徑不平衡[7,16]。結(jié)果表明，tHmg1，IDI1，ERG19，AFSLERG20是MVA途徑和α-法尼烯合成途徑的限速酶基因，過(guò)表達(dá)后可改善巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的合成。

圖2 α-法尼烯的生物合成途徑Fig.2 The biosynthetic pathway of α-farnesene注：二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，異戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，牻牛兒焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)，法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)

圖3 tHmg1與MVA途徑和α-法尼烯合成途徑基因分別組合過(guò)表達(dá)對(duì)巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of overexpression of tHmg1 in combination with genes of the mevalonate pathway and α-farnesene synthesis pathway on the production of α-farnesene in P.pastoris注：“+”代表包含對(duì)應(yīng)的基因；“-”代表不包含對(duì)應(yīng)的基因(下同)

2.3 過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑以及α-法尼烯合成途徑限速酶促進(jìn)α-法尼烯的合成

結(jié)果表明，tHmg1與AFSLERG20組合過(guò)表達(dá)對(duì)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)最大，其次是tHmg1與IDI1/ERG19。基于這些結(jié)果，選擇了tHmg1，IDI1，ERG19和AFSLERG20這4個(gè)關(guān)鍵酶基因，通過(guò)3個(gè)或者3個(gè)以上組合過(guò)表達(dá)嘗試進(jìn)一步提高菌株中α-法尼烯的產(chǎn)量。在菌株F12中，tHmg1，IDI1和AFSLERG20的組合過(guò)表達(dá)，α-法尼烯的產(chǎn)量與菌株F10相比分別提高約25.96%(圖4)。有趣的是，菌株F13中tHmg1，ERG19和AFSLERG20組合過(guò)表達(dá)與對(duì)照菌株F10相比，α-法尼烯產(chǎn)量反而降低約18.57%(圖4)。菌株F13是在F10的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)ERG19，推測(cè)可能是由于F13具有更高水平的ERG19酶的表達(dá)以造成有毒中間體IPP的積累，從而導(dǎo)致α-法尼烯產(chǎn)量降低[5]。

異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(由IDI1基因編碼)催化IPP向DMAPP的異構(gòu)化，并在GPP和FPP通量的分布中起關(guān)鍵作用[15]。為了驗(yàn)證猜想，通過(guò)在菌株F13引入1～2個(gè)拷貝IDI1基因，分別產(chǎn)生菌株F14和F15。菌株F14和F15的α-法尼烯產(chǎn)量達(dá)到約1.00 g/L，這暗示著平衡IPP和DMAPP池可能在增強(qiáng)倍半萜生物合成的碳通量中起重要作用。除此之外，構(gòu)建了菌株F16，在F15基礎(chǔ)上額外過(guò)表達(dá)1個(gè)拷貝AFSLERG20，α-法尼烯產(chǎn)量進(jìn)一步提高，如圖4所示，達(dá)到(1.09±0.02) g/L(菌株F1的2.42倍)。上述一系列組合的結(jié)果表明，優(yōu)化MVA途徑限速酶基因的組合表達(dá)可以有效地促進(jìn)畢赤酵母中倍半萜的異源生物合成。同時(shí)也揭示了在微生物宿主中建立高效的萜類(lèi)化合物途徑，必須小心平衡途徑中上下游代謝通量以避免有毒中間代謝物的積累。

圖4 限速酶基因組合過(guò)表達(dá)以及基因拷貝數(shù)優(yōu)化對(duì)巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯產(chǎn)生的影響Fig.4 Effects of rate-limiting enzyme gene combination overexpression and gene copy number optimization on the production of α-farnesene in P.pastoris

2.4 添加不飽和脂肪酸促進(jìn)α-法尼烯的分泌

小分子的萜類(lèi)化合物，例如倍半萜和類(lèi)黃酮，通常被分泌到細(xì)胞外[6]。然而，有限的細(xì)胞膜通透性是倍半萜分泌的障礙[6]。各項(xiàng)研究表明，增大不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)/飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)的比例有助于增加有毒物質(zhì)跨膜的膜通透性[6, 17-19]。同時(shí)，酵母細(xì)胞可以很容易地從培養(yǎng)基中吸收外源UFA和SFA，并迅速整合到膜脂質(zhì)中[19]。因此，通過(guò)向菌株F16培養(yǎng)基中外源添加脂肪酸，來(lái)試圖提高巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量。最初添加了10 mmol/L不飽和脂肪酸油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、棕櫚油酸(C16∶1)、飽和脂肪酸硬脂酸(C18∶0)和棕櫚酸(C16∶0)于菌株F16的培養(yǎng)基中，首先確定了不同脂肪酸對(duì)重組菌株的α-法尼烯產(chǎn)量以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖5所示，除了亞油酸，其他不飽和脂肪酸對(duì)α-法尼烯產(chǎn)量的提高均有積極影響，其中油酸的積極作用尤為顯著。之前的研究[19]和本研究都觀察到添加飽和脂肪酸對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的增加并沒(méi)有積極影響。脂肪酸的添加可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，這種促進(jìn)作用僅存在于3種不飽和脂肪酸中，飽和脂肪酸對(duì)菌體生長(zhǎng)均沒(méi)有促進(jìn)作用(圖5)。此外，亞油酸雖然對(duì)菌體生長(zhǎng)有積極作用，然而對(duì)MVA途徑似乎沒(méi)有促進(jìn)作用，這可能歸因于菌體對(duì)脂肪酸的利用有偏好性和菌株對(duì)不飽和脂肪酸氧化壓力的耐受能力不同[19]。因此選擇油酸來(lái)促進(jìn)α-法尼烯的分泌。為了最大程度地提高畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量，優(yōu)化了油酸添加濃度。如圖6所示，確定向細(xì)胞提供20 mmol/L的油酸獲得最佳的α-法尼烯產(chǎn)量約為1.40 g/L，收率約為0.07 g/g，生產(chǎn)率約為0.019 g/(L·h)。α-法尼烯產(chǎn)量是出發(fā)菌株F1的3.1倍。

圖5 外源添加不同脂肪酸對(duì)巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯合成的影響Fig.5 The effect of different fatty acids on the synthesis of α-farnesene in P.pastoris

圖6 外源添加油酸的最適濃度Fig.6 Optimal concentration of oleic acid

3 結(jié)論與討論

本研究是首次以發(fā)酵周期短，易高密度培養(yǎng)特性的巴斯德畢赤酵母作為底盤(pán)微生物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)α-法尼烯，揭示了MVA途徑和α-法尼烯合成途徑中限速步驟，對(duì)限速酶組合過(guò)表達(dá)并優(yōu)化基因拷貝數(shù)以平衡代謝途徑逐步提高α-法尼烯產(chǎn)量，最后通過(guò)外源添加不飽和脂肪酸促進(jìn)α-法尼烯分泌到細(xì)胞外，在搖瓶中菌株F16最終獲得α-法尼烯產(chǎn)量約1.40 g/L(0.32 g/g DCW)，生產(chǎn)率約為0.019 g/(L·h)。在搖瓶水平上，菌株F16的α-法尼烯生產(chǎn)率是解脂耶氏酵母[9]的1.38倍，大腸桿菌[3]的2.4倍，釀酒酵母[22]的3.8倍。盡管巴斯德畢赤酵母工程菌中α-法尼烯產(chǎn)量顯著提高，但是競(jìng)爭(zhēng)途徑[13]以及代謝串?dāng)_[23]仍然是阻止目標(biāo)化合物有效合成的障礙。因此，減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑和代謝串?dāng)_將是未來(lái)努力的方向。總之，以巴斯德畢赤酵母作為底盤(pán)微生物生產(chǎn)α-法尼烯是非常有前景的，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)α-法尼烯提供新的希望。